课题3　血红蛋白的提取和分离优秀说课稿

二、缓冲溶液

1、定义：在一定范围内，缓冲液能够抵制外界的 和 对溶液 的影响，维持 基本不变。

2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH 。

3、配制：通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使

用的缓冲液。

4、缓冲剂：人体血浆的为H2CO3/NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4

5、实验必须使用缓冲溶液的原因：维持反应体系的pH不变。

三、电泳

1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。

（1）.许多重要的生物大分子，如 、 等都具有 ，在一定的

下，这些基团会带上 或 。

2、原理

（2）.在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 的电极移动。

（3）.电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不

同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。

3、电泳的类型：常用的电泳方法是 和 等2种，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

以及 等因素。

4、SDS的作用：使蛋白质发生完全 ，水解成单条肽链，使电泳迁移率完全取决于 。

二、实验操作

1、基本步骤：样品处理

→

粗分离

→

纯化

→

纯度鉴定

2、特别强调：每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质的不同差异 。

（一）样品处理及粗分离

1、血液组成

①.元素组成：红色含铁的携氧蛋白质

。

②.分子结构：血红蛋白由 条链组成，两条α链和两条β链。 2、血红蛋白 ③.颜色：红色。

④.存在细胞是红细胞的主要成分

。

⑤.生理功能运输O2和部分CO2

⑥.获得方法凝胶色谱法

2

步骤：

1、红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，以利分离纯化。采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 液体倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。

2、血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

3、分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层：

第1层为无色透明的 ，

第2层为白色薄层固体，是 ，

第3层是红色透明液体，这是 ，

第4层是其他杂质的 。 将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的

红色透明液体。

4、透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，

将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为

20mmol/L的 中，透析12h。透析

可以去除样品中 的杂质，

或用于更换样品的 。如右图：

注意：

1、加入柠檬酸钠的目的是_________________________。

2、洗涤操作过程中，低速短时间离心的作用：速度越高和时间越长会使其它血细胞等同沉淀达不到分离的效果。

3、使红细胞洗涤干净的方法是：重复洗涤三次，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。 4、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤的作用是：维持细胞形态。不能用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液。

5、蒸馏水和甲苯的作用：使红细胞破裂，释放出 。

6、采用 分离血红蛋白。

7、用滤纸过滤，去掉是 。

8、透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分子（淀粉、蛋白质等）不能通过，留在袋内。

9、透析目的：除去血红蛋白溶液中分子量较小的 。

（二）凝胶色谱操作

1、制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→插管

2、凝胶色谱柱的装填

（1）凝胶的选择：

A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。

B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

（2）凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

3

（3）凝胶色谱柱的装填方法：

A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。

B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

（4）洗涤平衡：

装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。

注意：

1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有 存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

3、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

橡皮塞

冲洗瓶

移液管下端

色谱柱

凝胶色谱柱专装置 加样示意图

3、样品加入与洗脱

（1）.调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面 ，关闭出口。

（2）.滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环 加样，

同时注意不要 凝胶面。

（3）.样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出

口。

（4）.洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行

洗脱。

（5）.收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离

过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

（6）.注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

三、实验结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

4

于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

注意：

1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构

和功能正常。

2、与其他蛋白质相比，血红蛋白的特点和分离的启示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通

过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3、血红蛋白分离的完整过程：

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；

再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；

然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；

最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

例1：凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。

A．分子的大小 B．相对分子质量的大小 C．带电荷的多少 D．溶解度

例2：缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。

A．温度

B．pH

C．渗透压

D．氧气浓度

例3：电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。

A．相同

B．相反

C．相对

D．相向

例4：哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。

A．血红蛋白

B．肌红蛋白

C．肌动蛋白

D．肌球蛋白

例5：血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。

A．白细胞

B．血小板

C．红细胞

D．淋巴细胞

例6：为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）

A．NaCl

B．甲苯

C．蒸馏水

D．柠檬酸钠

例7：将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ）

A．无色透明的甲苯层 B．脂溶性物质的沉淀层 C．血红蛋白的水溶液

D．其他杂质的暗红色沉淀物

例8：利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是（ ） A．相对分子质量大的 B．溶解度高的

C．相对分子质量小的 D．所带电荷多的

例9：凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ）

A．糖类化合物 B．脂质

C．蛋白质

D．核酸

例10：相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（ ）

5

例11：用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ） A．路程较长，移动速度较慢

C．路程较短，移动速度较慢

B．路程较长，移动速度较快

D．路程较短，移动速度较快

例12：能进入凝胶内部通道的蛋白质是指（ ） A．相对分子质量大的 B．吸附性高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的

例13：缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的（ ） A．温度

B．pH C．渗透压 D．氧气浓度

例14：初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为（ ） A．H2 CO3一NaHCO3缓冲液 B．NH4OH—NH4Cl缓冲液 C．CH3 COOH—CH3 COONa缓冲液 D．H3PO4缓冲液

例15：蛋白质提取和分离分为哪几步（ ） A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

例16：血红蛋白因含有什么物质而呈红色（ ） A．O2

B．CO

C．CO2

D．血红素

例17：将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ） A．甲苯

B．血红蛋白水溶液 C．脂溶性物质的沉淀层 D．其他杂质的沉淀

例18：分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于（ ） A．一

B．二

C．三

D．四

例19：下列操作正确的是（ ） A．分离红细胞时采用低速长时间离心 B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h

例20：使用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的迁移速度完全取决于（ ） A．电荷的多少 B．分子的大小 C．肽链的多少 D．分子形状的差异

例21：下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是（ ） A．先加入1 mL透析后的样品

B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出

C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功 D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

例22：洗涤红细胞的目的是（ ） A．去除血清

B．去除杂蛋白 C．除去血小板 D．除去水

例23：洗涤红细胞时，分离所用的方法为（ ） A．低速长时间离心

B．低速短时间离心 C．高速长时间离心

D．高速短时间离心

例24：SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是（ ） A．增大蛋白质的相对分子质量 B．改变蛋白质的形状

C．掩盖不同种蛋白质问的电荷差别 D．减少蛋白质的相对分子质量

例25：制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是（ ）

A．移液管头部5 cm B．移液管尾部5 cm C．移液管头部3 cm D．移液管尾部3 cm 例26：在下列哪一种条件下生物大分子具有的可解离的基团会带上正电或负电（ ） A．一定温度

B．一定pH C．一定压强

D．一定容器

例27：电泳时带电粒子在电场的作用下，移动所向的电极的方向与其所带电荷是（ ） A．相同

B．相反

C．相对

D．相向

例28：装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应（ ）

6

A．先打开后关闭 B．关闭

例29：D亚铁血红素基团可携带（ ） A．一分子CO B．一分子NO 2+

C．先关闭后打开 D．打开

C．一分子O2或CO2 D．一分子NO2

2+3+例30：人体正常的血红蛋白中应含有Fe，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe。转化为Fe，产生高价铁血红蛋白而中毒。服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反应中（ ） A．亚硝酸盐是还原剂 B．维生素C是氧化剂 C．亚硝酸盐被氧化 D．维生素C将Fe还原为Fe

例31：加有少量柠檬酸钠（防止血液凝固）的猪血分装于标号①、②、③的试管中，随后依次加入质量分数为0．3％、0．9％和1．5％的氯化钠溶液稀释，30 min后离心。下列叙述中，正确的是（ ） A．①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞

B．②和③试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有皱缩的红细胞

C．①和③试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞

D．②和③试管的上清液是血清

例32：在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是（ ） A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和

C．防止血红蛋白被02氧化 D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

例33：在盛有红褐色的Fe（OH）3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明（ ） A．Fe（OH）3胶体粒子带正电荷，向阴极移动 B．Fe（OH）3胶体粒子带负电荷，向阳极移动

C．Fe（OH）3胶体粒子带正电荷，向阳极移动 D．Fe（OH）3胶体粒子带负电荷，向阴极移动

例34：下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）

A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

例35：凝胶色谱法操作正确的是（ ） A．将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B．将橡皮塞下部切出凹穴

C．插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D．将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片

例36：样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

例37：下列说法不正确的是（ ） A．血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌

B．血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体

C．血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物

D．血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液

例38：选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列不是其优点的是 A．血红蛋白是有色蛋白 B．红细胞无细胞核 C．红细胞蛋白质含量高 D．红细胞DNA含量高

例39：下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是

7 3+2+

A．采集血样后要高速短时问离心不能获得血细胞

B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。

C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白

D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来

例40：凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1．6 cm，有关说法中，正确的是 A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果 B．凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果

C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度

D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大

例41：下列有关提取和分离血红蛋白的过程的叙述中，正确的是 A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B．通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D．可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

例42：凝胶色谱法中移动得快的是（ ）

A．相对分子质量大的 B．溶解度高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的

例43：下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是(

) ．A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法

B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，以致最后流出

C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系

D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来

例44：关于电泳的说法不正确的是(

) ．A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

例45：(2011年宿州高二检测)下列操作正确的是(

) A．分离红细胞时采用低速长时间离心 B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D．透析时要用20 m mol/L的磷酸缓冲液，透析12 h

例46：有关缓冲溶液的说法不正确的是(

) ．A．缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液

D．生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行

例47：已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是(

) A．若将样品以2000 r/min的速度离心10 min，

分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中

B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快

C．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内

8

D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远

例1：(2011年邵阳高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列问题。

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用

体现了蛋白质具有__________功能。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是________________；乙装置中，

C溶液的作用是____________________。

(3)甲装置用于____________，目的是________________________。用乙装置

分离蛋白质的方法叫__________________，是根据____________________分离蛋白质的有效方法。

(4)用乙装置分离血红蛋白时，待__________________________________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。

例2：早在上世纪六十年代，在美国的黄石国家森林公园发现了一种嗜热细菌，从这种细菌中分离提取了一种酶，称为TaqDNA聚合酶。实验得知PCR反应变性时温度为95C，经50个循环后TaqDNA聚合酶仍有65%的活性； TaqDNA聚合酶表现为Mg依赖，浓度在2．0mmol/L的MgCl2能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性

； （1）若要培养嗜热细菌，培养基中应有水、碳源、 、 等营养物质。在此基础上，培养该菌时需先将培养基 ____ 。

（2）若将培养细菌的培养基用于植物组织培养，还应加入 ________ 。

（3）TaqDNA聚合酶可用于PCR，原因是该酶有 ，因此在PCR扩增时可以 加入。

（4）请将下列实验流程图补充完整：

（5）凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。

①凝胶色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的 不同而实现分离的：

②使用电泳法分离蛋白质．是利用了待分离样品中各种分子的 差异，以及分子本身的 、形状的不同。

例3：《“十一五”将建12项重大科技基础设施》被2007年12月28日评为2007年国内十大科技新闻之一，其中的12项中的一项为“蛋白质科学研究设施”。这是由于随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因测序工作的完成，人类跨入了蛋白质时代。对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：

（1）蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________、________、_________和纯度鉴定。

（2）如果要从红细胞中分离出血红蛋白，实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠

檬酸钠，这样做的目的是__________________________________。

（3）血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、______________、分离血红蛋白溶

液和_______。其中分离血红蛋白溶液时需要用到_______（仪器）分出下层红色透明液体。

（4）装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。

这是因为____________________________________________。

2+0

9