课题3　分解纤维素的微生物的分离教学设计案例

课题3

分解纤维素的微生物的分离

一、纤维素与纤维素酶

1．纤维素

(1)化学本质：由C、H、O三种元素组成，基本组成单位是葡萄糖，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

(2)分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外木材、作物秸秆等也富含纤维素。

2．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。

(2)作用原理

纤维素――――――→纤维二糖―――――――→葡萄糖

二、纤维素分解菌的筛选阅读教材P28

1．方法：刚果红染色法。

2．原理

C1酶和CX酶葡萄糖苷酶

三、实验设计和操作

1．土壤取样：选择富含纤维素的环境。

2．选择培养

(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，

在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。

3．刚果红染色法

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

方法二：在倒平板时就加入刚果红

四、课题延伸——纤维素分解菌的鉴定

阅读教材P30

1．为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

2．纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

1．纤维素酶的种类和作用是什么？

2．纤维素分解菌的筛选方法和筛选原理是什么？

3．鉴别纤维素分解菌的原理是什么？

4．纤维素分解菌的分离过程是怎样的？

5．纤维素酶的测定方法是什么？

探究点一

[共研探究]

纤维素分子的结构如图所示，结合教材回答下列问题：

纤维素分解菌筛选的原理

1．纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物产生的纤维素酶分解。

2．纤维素酶

(1)纤维素酶是一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

(2)纤维素酶作用过程

纤维素――――――→纤维二糖――――――→葡萄糖

3．纤维素分解菌的筛选

(1)利用刚果红染色法筛选纤维素分解菌。

(2)刚果红染色法筛选的原理是什么？

提示：

C1酶、CX酶葡萄糖苷酶

[总结升华]

1．纤维素酶作用的实验验证

缓冲液

pH＝4.8 纤维素酶

(70～

80 U/mL) 1 mL 将两支试管固定在50 mL的锥形瓶中，在摇床上11 mL －

以140 r/min的完全

分解

基本无

条件

结果

试管

滤纸条

1 1 cm×

6 cm 1 cm×

6 cm 10 mL 2

转速振荡反应1 h 2.两种刚果红染色法的比较

项目

内容

方法一

培养基上长出菌落→覆盖质量浓度为1 mg/mL的CR溶液10～15 min变化

方法二

配制CR溶液→灭菌→按照1 mL CR/200 mL培养基比例混匀→倒平板→培养→出现透明圈

过程

――→倒去CR溶液→加入

15 minNaCl溶液――→倒掉NaCl溶液

→出现透明圈

优点

显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

制作烦琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂

操作简便，不存在菌落混杂问题

缺点

【知识拓展】

容易出现假阳性反应

(1)方法一中加入NaCl溶液的作用：洗去未和纤维素结合的刚果红染液，留下大大小小的透明圈(透明圈较大说明纤维素分解菌分解纤维素能力较强)。

(2)方法二中出现假阳性反应的原因：

①由于纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即出现假阳性反应。

②有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈。

[对点演练]

1．下列关于纤维素与纤维素酶的叙述，错误的是(

) A．牛、羊等草食动物可以合成纤维素酶，从而利用纤维素

B．纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分

C．纤维素可被纤维素酶分解成葡萄糖，为微生物提供营养物质

D．分解纤维素的细菌、真菌、放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的

解析：选A

牛、羊等草食动物不能合成纤维素酶，它们之所以能利用纤维素是因为它们的瘤胃中有许多可分泌纤维素酶的微生物；纤维素被纤维素酶分解后的产物是葡萄糖，葡萄糖可作为微生物的营养物质；能分解纤维素的微生物都能产生纤维素酶，它们通过纤维素酶来分解纤维素。

2．下列关于刚果红染色法的说法，正确的是(

)

A．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，不需用NaCl溶液洗去浮色

B．倒平板时就加入刚果红，可在培养皿中先加入1 mL CR溶液后加入100 mL培养基

C．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，不会使菌落之间发生混杂

D．倒平板时就加入刚果红，长期培养刚果红有可能被其他微生物分解形成透明圈

解析：选D

刚果红可以在菌落形成后加入，需要用NaCl溶液洗去浮色；可以将刚果红与培养基分别灭菌，按一定的比例将刚果红加入培养基中，然后倒平板；刚果红不与纤维二糖和葡萄糖发生反应，先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应会使菌落之间发生混杂；倒平板时就加入刚果红，在长期培养过程中刚果红有可能被其他微生物分解形成透明圈。

探究点二

[共研探究]

1．分析本课题使用的两种培养基的配方回答问题：

配方1：纤维素分解菌的选择培养基

培养基组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

含量

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 实验设计与操作提示

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL

配方2：鉴别纤维素分解菌的培养基

培养基组分

CMC-Na 酵母膏

KH2PO4

琼脂

土豆汁

含量

5～10 g 1 g 0.25 g 15 g 100 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL (1)配方1所示培养基按物理性质划分属于液体培养基，因为没有加入琼脂(凝固剂)；按功能划分属于选择培养基，该培养基的主要碳源为纤维素粉，只有能分解该物质的微生物

才能生存。

(2)配方2所示培养基按物理性质划分属于固体培养基，按功能划分属于鉴别培养基，在该培养基中加入刚果红溶液，在纤维素分解菌的周围会形成透明圈。

(3)若要设置对照实验说明选择培养的作用，应将配方中的纤维素粉换成葡萄糖。

2．完善分离纤维素分解菌的实验流程图

[总结升华]

1．筛选纤维素分解菌的注意事项

(1)为确定得到的细菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产生纤维素酶的实验。因为形成透明圈的菌落与其他微生物菌落可能出现混杂现象，而且产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌种。

(2)流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。

(3)本实验的流程与课题2的流程有一定的区别。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。

【归纳拓展】

尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与鉴定的比较

项目

条件

鉴定方法

鉴定原理

尿素分解菌的分离与鉴定

尿素为唯一氮源

在培养基中加入酚红指示剂

细菌合成的脲酶使尿素分解成氨，氨使培养基pH升高，酚红指示剂变红

分解纤维素的微生物的分离与鉴定

纤维素为主要碳源

在培养基中加入刚果红溶液

微生物产生的纤维素酶能使纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使刚果红－纤维

素复合物无法形成而出现透明圈

步骤

土壤取样→样品梯度稀释→涂布平板→培养与观察

土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布培养→挑取菌落

2.结果分析与评价

(1)培养基的制作是否合格：

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。

(2)选择培养基是否筛选出目的菌：如果鉴别培养基中观察到了产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

(3)分离的结果是否一致：

能够分解纤维素的微生物种类很多，不仅有细菌，还有霉菌、放线菌等。这些微生物的菌落特征各不相同，分解纤维素的能力也不相同，所以形成的菌落大小、形态以及透明圈的大小并不相同。由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是能够分解纤维素的细菌。但由于所取土样的环境不同，也可能得到能够分解纤维素的真菌和放线菌等不同的分离结果。

【易错易混】

对两种对照培养基的正确理解

判断某个选择培养基是否具有选择作用时，应设立基础培养基进行对照；若判断所使用的培养基灭菌是否彻底，应设立不接菌种的该种培养基进行空白对照。

[对点演练]

3．(2018·宜宾质检)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分如表所示)。下列关于培养基甲和乙能否用于分离和鉴别纤维素分解菌的说法，正确的是(

) 项目

培养基甲

培养基乙

酵母膏

＋

＋

无机盐

＋

＋

淀粉

＋

＋

纤维素粉

＋

－

琼脂

－

＋

CR溶液

＋

＋

水

＋

＋

注：“＋”表示有，“－”表示无。

A．培养基甲能，培养基乙不能

B．培养基甲不能，培养基乙能

C．培养基甲和乙都能

D．培养基甲和乙都不能

解析：选D

利用以纤维素为唯一碳源的选择培养基可以筛选出分解纤维素的微生物；鉴别纤维素分解菌的培养基为含有纤维素的固体培养基，且需加入刚果红溶液。

4．下列关于分离纤维素分解菌的实验操作有误的是(

) A．经选择培养后将样品接着涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B．选择培养这一步可省略，但得到的纤维素分解菌会较少

C．可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量

D．对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到不含纤维素的培养基上

解析：选A

经选择培养后，再经梯度稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养(目的是富集培养)可省略，但培养分离到的纤维素分解菌较少；在单位时间内产生的葡萄糖越多则酶产量越高，故可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量；设置对照能证明经选择培养(富集培养)的确得到了欲分离的微生物。

1．下列有关分解纤维素的微生物的分离实验的叙述，错误的是(

) A．纤维素酶是一种复合酶

B．在倒平板时加入刚果红不需要灭菌

C．纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵

D．纤维素酶的测定方法一般是对其分解纤维素所产生的葡萄糖进行定量的测定

解析：选B

纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶；刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌；纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵；纤维素酶的测定方法一般是对其催化产物葡萄糖进行定量的测定。

2．分解纤维素的微生物的分离实验的具体操作步骤是(

) ①土壤取样

②将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

③挑选产生透明圈的菌落

④选择培养

⑤梯度稀释

A．①④⑤②③

C．①⑤④③②

B．①⑤②④③

D．①③⑤④②

解析：选A

分解纤维素的微生物的分离实验的具体操作步骤是：①土壤取样→④选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)→⑤梯度稀释→②将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上→③挑选产生透明圈的菌落。

3．纤维素分解菌的筛选原理是(

) A．刚果红可以与纤维素形成红色复合物

B．刚果红可以与分解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物

C．刚果红可以与纤维素酶形成红色复合物

D．刚果红可以与纤维素分解菌结合形成红色复合物

解析：选A

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和分解后的纤维二糖及葡萄糖发生这种反应，也不与纤维素酶或纤维素分解菌结合形成红色复合物。

4．研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物。请回答下列有关问题：

(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和____________酶。

(2)如果要对土壤中的纤维素分解菌进行计数，常采用____________法进行接种培养，接种工具采用__________________________________的方法灭菌。

(3)常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在________时就加入刚果红。________(填“第一种”或“第二种”)方法会使菌落之间发生混杂。

(4)如果观察到产生________的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行________________的实验。纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量的测定。

解析：(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。(2)若对菌株进行计数，常采用稀释涂布平板法进行接种，此过程所用的接种工具是涂布器，灭菌时采用沾少量酒精，在火焰上引燃的方法。(3)常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在倒平板时就加入刚果红。第一种方法会使菌落之间发生混杂。(4)如果观察到产生透明圈的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

答案：(1)葡萄糖苷

(2)稀释涂布平板

沾少量酒精，在火焰上引燃

(3)倒平板

第一种

(4)透明圈

发酵产纤维素酶

葡萄糖

【基础题组】

1．下列关于纤维素的叙述，错误的是(

) A．纤维素是由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物

B．纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为这些微生物能产生纤维素酶

C．植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素

D．自然界中的各种生物均能把纤维素分解成葡萄糖，从而为生物体提供能量

解析：选D

自然界中只有部分能够合成纤维素酶的生物才能分解纤维素。

2．使用刚果红染色时，加入刚果红应在(

) ①制备培养基时

②梯度稀释时

③倒平板时

④涂布时

⑤长出菌落时

A．①③

C．③⑤

B．②⑤

D．④⑤

解析：选C

常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，长出菌落后再加入刚果红进行颜色反应；另一种是倒平板时就加入刚果红。最终两种染色法都可以在培养基上观察到以纤维素分解菌为中心的透明圈。

3．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在(

) A．加入指示剂的鉴别培养基上

B．含有蛋白胨的固体培养基上

C．只含纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上

D．含四大营养要素的培养基上

解析：选C

选择纤维素分解菌的培养基中应含有该种

菌生长发育所需的营养条件，且其他菌种在这种培养基中不能生存。

4．在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前一般先进行选择培养，其主要目的是(

) A．分离纤维素分解菌

B．加快纤维素分解菌的生长速度

C．使纤维素分解菌均匀地分布在稀释液中

D．增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物

解析：选D

纤维素分解菌的选择培养基中富含纤维素，主要适合于能产生纤维素酶的纤维素分解菌的生长，所以选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。

5．在加入刚果红的培养基中会出现透明圈，产生的透明圈是(

) A．刚果红与纤维素形成的复合物

B．刚果红与纤维二糖形成的复合物

C．纤维素分解后形成的葡萄糖导致的

D．以纤维素分解菌为中心形成的

解析：选D

刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，但并不和分解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

6．在纤维素分解菌的鉴定实验中，纤维素酶的测定方法一般是(

)

A．对纤维素进行定量测定

B．对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定

C．对纤维素酶分解纤维素后所产生的纤维二糖进行定量测定

D．对纤维素分解菌进行定量测定

解析：选B

在纤维素分解菌的鉴定实验中，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

7．在分离纤维素分解菌过程中往往需要振荡，其作用不包括(

) A．使纤维素分解菌与培养基混合均匀

B．使纤维素分解菌能充分吸收氧气

C．使纤维素分解菌能快速繁殖

D．防止纤维素分解菌失水

解析：选D

振荡的作用是使细菌与培养基充分接触，并充分吸收氧气，从而使其生命活动旺盛，繁殖加快。

8．下列有关纤维素分解菌分离实验的叙述，错误的是(

) A．该实验过程中选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度

B．将分离得到的菌种接种在加入伊红美蓝的鉴别培养基上

C．当纤维素被纤维素分解菌释放的酶分解后，培养基上会出现透明圈

D．一般用刚果红染色法鉴别纤维素分解菌

解析：选B

通过选择培养可以增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；将分离得到的菌种接种到选择培养基上；纤维素被纤维素分解菌释放的酶分解后，培养基上会出现透明圈；纤维素分解菌常用刚果红染色法进行鉴定。

【能力题组】

9．下列关于纤维素酶的叙述，错误的是(

) A．纤维素酶是一种复合酶，能将纤维素分解为葡萄糖

B．纤维素酶的组成单位是氨基酸

C．纤维素酶在微生物细胞内合成并发挥作用

D．筛选可产生纤维素酶的微生物，应在富含纤维素的环境中取土样

解析：选C

纤维素酶由C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶组成，其中C1酶、CX酶可将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解为葡萄糖；纤维素酶的化学本质是蛋白质，基本组成单位为氨基酸；纤维素酶在微生物细胞内合成，分泌到细胞外分解纤维素；筛选可产生纤维素酶的微生物，应在富含纤维素的环境中取土样。

10．如表为某培养基的配方，有关叙述正确的是(

) 成分

纤维素粉

Na2HPO4·7H2O NaNO3

KH2PO4

MgSO7H24·KCl 酵母膏

水解酪素

O 含量

5 g 1.2 g 1 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g A.此培养基为鉴别培养基

B．此培养基上能生长分解尿素的细菌

C．此培养基属于固体培养基

D．在此培养基上能生长的细菌可产生纤维素酶

解析：选D

该培养基中主要碳源为纤维素粉，因此为筛选纤维素分解菌的选择培养基，因该培养基中没有加琼脂，因此不属于固体培养基。

11．使用液体选择培养基培养纤维素分解菌的目的是(

) ①用液体选择培养基可获得大量纤维素分解菌

②用液体培养基便于稀释涂布平板

③纤维素分解菌只能在液体培养基中生长

④用液体培养基可鉴别纤维素分解菌

A．①②

C．②④

B．①③

D．③④

解析：选A

使用液体选择培养基培养纤维素分解菌，一方面可以获得大量的纤维素分解菌，另一方面便于稀释涂布平板。纤维素分解菌也可以在固体培养基上生长；鉴别纤维素分解菌使用的是固体培养基。

12．下列有关纤维素分解菌分离实验的说法错误的是(

) A．刚果红不能与纤维素分解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物

B．在用刚果红染色时既可以先培养微生物再加入刚果红，也可以在倒平板时直接加入

C．该实验需用到选择培养基和鉴别培养基

D．在用刚果红染色过程中，若将微生物培养在事先加入刚果红的培养基上，则出现透明圈的菌落一定为所需菌种

解析：选D

刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解成纤维二糖和葡萄糖后，红色复合物无法形成；刚果红染色有两种方法，一种是先培养微生物再加入刚果红，另一种是在倒平板时就将刚果红染液加入培养基中，然后再培养微生物；该实验富集纤维素分解菌时需要选择培养基，筛选时需要鉴别培养基；有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，因此出现透明圈的菌落不一定为所需菌种。

13．(2018·石家庄质检)为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行如图A所示的实验。

(1)配制好的培养基通常使用______________法灭菌。步骤③与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是步骤③培养基中______________________。

(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是____________________，出现图B结果可能的失误操作是______________________。

(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为________个。

(4)步骤⑤需要振荡培养，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

解析：(1)使用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。步骤③与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是步骤③中使用的培养基内石油是唯一碳源。(2)根据图B所示平板经培养后的菌落分布可知，该同学的接种方法是稀释涂布平板法。平板上菌落聚集分布，出现这种结果可能的失误操作是涂布不均匀。(3)每升样品中的活菌数＝(56＋57＋58)/3×10×100×1 000＝5.7×107(个)。(4)振荡可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，并且提高培养液中(溶解)氧的含量。(5)为了筛选出分解石油能力最强的细菌，步骤⑤后取样测定石油含量，选取石油含量最低的菌种作为分解石油能力最强的菌株。

答案：(1)高压蒸汽灭菌

石油是唯一碳源

(2)稀释涂布平板法

涂布不均匀

(3)5.7×107

(4)提高培养液中(溶解)氧的含量，通过振荡可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率

(5)筛选出分解石油能力最强的细菌

14．莠去津是一种含氮农药，在土壤中不易降解，为修复被其污染的土壤，可按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。请据图回答(已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明)：

(1)由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的过程称为________，目的是________________________________________________________________________。

(2)在将C瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行________，将菌种接种到固体培养

基的方法有平板划线法和______________法，从图中看本实验采用的是________(填“前者”或“后者”)。

(3)一段时间后，培养基出现无透明圈和有透明圈两种菌落，筛选的目的菌是____________菌落中的细菌，该菌落生长所需的氮元素主要来源于________。

(4)为弄清固体培养基中的非目的菌是来自C瓶菌种还是培养基，应如何设置对照组？________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

解析：(1)图中从A瓶到C瓶液体培养过程为选择培养，目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并增加其数量。(2)将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种，由图中固体培养基上的菌落分布比较均匀可知，该接种方法是稀释涂布平板法，包括梯度稀释操作和涂布平板操作。(3)根据题目信息“莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明”可知，能够降解莠去津的目的菌可分解莠去津，使菌落周围出现透明圈，因此选择菌落周围存在透明圈的细菌。由于培养基中只有莠去津一种氮源，因此分解莠去津的微生物所需的氮源主要由莠去津提供。(4)为弄清固体培养基中的非目的菌是来自C瓶菌种还是培养基，应设置灭菌后不接种菌种的空白培养基进行对照，两种培养基放在相同条件下培养，若空白培养基上无菌落出现，则非目的菌一定来自C瓶菌种，若空白培养基上出现菌落，则说明非目的菌可能来自培养基。

答案：(1)选择培养

初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并增加其数量

(2)梯度稀释

稀释涂布平板

后者

(3)有透明圈

莠去津

(4)配制的培养基灭菌后不接种菌种，与实验组放在相同条件下培养

15．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。

(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。

(3)右图为连续划线法示意图，在图中____________(填图中序号)区域更易获得单菌落。

(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________________________________________________________________________。

管号

苯酚浓度(mg/L) 1

2

3

4

5

6 1 如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5

②10

③20)倍后，再进行比色。

解析：(1)富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加凝固剂(如琼脂)。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域(③)中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L；根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍左右。

答案：(1)蛋白胨、苯酚

(2)增加

稀释涂布

凝固剂

(3)③

(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8

③

阶段质量检测(二)

微生物的培养与应用

(时间：60分钟；满分：100分) 一、选择题(每小题2.5分，共50分) 1．下列常用的无菌操作中错误的是(

) A．用酒精擦拭双手

B．玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭

C．实验操作应在酒精灯火焰附近进行

D．用氯气消毒水源

解析：选B

双手可用酒精擦拭来进行消毒；玻璃器皿(吸管、培养皿)需要进行灭菌处理，一般采用干热灭菌法；实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以防止空气中的杂菌污染；水源可用氯气进行消毒。

2．牛奶、吸管、接种环、培养基、空气消毒和灭菌的方式依次是(

) ①灼烧灭菌

②巴氏消毒法

③干热灭菌

④紫外线消毒

⑤高压蒸汽灭菌

A．②③①⑤④

C．②①③⑤④

B．②⑤③①④

D．⑤①③②④

解析：选A

对于不耐高温的液体消毒用巴氏消毒法，如牛奶；吸管为耐高温又要保持干燥的玻璃器皿，采用干热灭菌法；接种环往往采用灼烧灭菌法；培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌比较彻底；空气灭菌常用紫外线照射法。

3．(2018·苏州调研)关于实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作，下列说法正确的是(

) A．配制培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行

B．倒平板时，倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖

C．划线接种时，灼烧接种环后立即进行再次划线

D．划线接种结束后，需将平板倒置后放入培养箱中培养

解析：选D

配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行，倒平板和接种需要在火焰旁进行；倒平板时，应立即盖上培养皿的皿盖；划线接种时，灼烧接种环冷却后进行再次划线。

4．下列有关平板划线操作的叙述，错误的是(

) A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物

B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上的菌种

C．划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连

D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者

解析：选C

划线时要避免最后一区的划线与第一区的划线相连。

5．用稀释涂布平板法统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是(

) A．平板上的一个菌落就是一个细菌

B．菌落中的细菌数是固定的

C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌

D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同

解析：选C

当稀释倍数适宜时，培养基上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，但也可能由两个或两个以上活菌生长而成，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数低。

6．防止外来杂菌的入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是(

) A．实验室内可以用紫外线或化学药剂进行消毒

B．接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌

C．在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染

D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境

解析：选B

实验室内可以用紫外线或化学药剂进行消毒；灼烧灭菌应该在酒精灯火焰的外焰部位灼烧；实验室是经过特殊处理的场所，为防止被微生物感染，切不可在实验室中吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手；使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。

7．下列有关培养基配制原则的叙述，正确的是(

) A．任何培养基都必须加入碳源、氮源、矿质元素及水

B．碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素

C．微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、氧、温度等条件的影响

D．营养物质的浓度越高越好

解析：选C

培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源；碳源和氮源必须具有一定比例，但碳元素的含量不一定最多，自养型微生物的培养基不需要碳源；微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、氧、温度等条件的影响；营养物质浓度过高会导致微生物失水死亡。

8．下列关于微生物实验室培养的叙述，错误的是(

) A．平板划线法是在培养基上连续划线以纯化菌种的接种方法

B．培养霉菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性

C．培养硝化细菌时可不用在培养基中加有机碳源

D．培养乳酸菌时需要提供无氧的条件

解析：选B

平板划线法是在培养基上连续划线以纯化菌种的接种方法；培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性；硝化细菌是自养微生物，可以利用CO2合成有机物，培养时可以不在培养基中加有机碳源；乳酸菌是厌氧微生物，培养时需要提供无氧的条件。

9．用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时(

) ①可以用相同的培养基

②都需要使用接种针进行接种

③都需要在酒精灯火焰旁进行接种

④都可以用来计数活菌

A．①②

C．①③

B．③④

D．②④

解析：选C

平板划线法和稀释涂布平板法都使用固体培养基，①正确；平板划线法采用接种环(针)进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，②错误；进行接种操作时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物污染培养基，③正确；平板划线法一般用于分离菌体而不能计数活菌，④错误。

10．下列有关刚果红染色法的叙述，错误的是(

) A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入

B．刚果红可以在菌落形成后加入

C．刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌

D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌

解析：选C

刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌污染，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入，则刚果红不需要灭菌。

11．下列关于微生物培养和利用的叙述，错误的是(

) A．利用稀释涂布平板法可对微生物进行计数

B．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落

C．在无氮培养基中加入酚红指示剂可用来鉴定尿素分解菌

D．利用刚果红培养基上是否形成透明圈来筛选纤维素分解菌

解析：选C

统计微生物的数目时应选用稀释涂布平板法；菌液经过连续划线，菌液中的菌体越来越少，最后可形成单菌落；鉴定尿素分解菌的培养基不是无氮培养基，其唯一氮源是尿素，尿素分解菌分解尿素形成了氨，氨会使培养基的碱性增强，可用酚红试剂鉴定；当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

12．如表所示为某微生物培养基的配方。下列叙述错误的是(

) 成分

NaNO3

K2HPO4

KCl MgSO4·7H2O 0.5 g FeSO4

(CH2O) 30 g H2O 1 000 mL 青霉素

0.1万单位

含量

3 g 1 g 0.5 g 0.01 g A.此培养基属于液体培养基，其中的碳源是(CH2O) B．配制培养基时，溶化后分装前，必须要进行的是调整pH和灭菌

C．接种时应在酒精灯火焰附近操作

D．若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去青霉素，加入的是纤维素粉

解析：选D

此培养基中没有琼脂等凝固剂，属于液体培养基；配制培养基时，在溶化后分装前，必须要进行的是调整pH和灭菌，这是最关键的一个环节；接种时应在酒精灯火焰附近操作；若用该培养基培养纤维素分解菌，应除去的物质是青霉素和(CH2O)，应加入的物质是纤维素粉，提供碳源。

13．在培养细菌的实验过程中，“温度”的控制合理的是(

) A．必须在37 ℃下才能获得单菌落

B．可在28 ℃下培养

C．倒平板时应该让温度降到40 ℃

D．对培养基灭菌时应该是121 ℃

解析：选D

细菌是一大类生物，培养温度因菌种不同而不同，一般在30～37 ℃，应根据具体情况确定培养温度；倒平板时应该让温度降到50 ℃左右；培养基采用高压蒸汽灭菌法灭菌，要在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min。

14．“筛选”是生物学中培育生物新类型常用的手段，下列有关技术过程中不可能筛选成功的是(

) A．在无氮培养基上筛选圆褐固氮菌

B．在不含精氨酸的培养液中筛选能合成精氨酸的杂交细胞

C．用含青霉素的培养基筛选酵母菌和霉菌

D．用不含碳源的培养基筛选根瘤菌

解析：选D

圆褐固氮菌可以固定氮气，所以在无氮培养基上能生长；青霉素可抑制细菌细胞壁的形成，而对酵母菌和霉菌无抑制作用；根瘤菌是异养生物，在不含碳源的培养基上不能生长。

15．下列关于分离尿素分解菌和纤维素分解菌实验的叙述，错误的是(

) A．前者需要尿素为唯一的氮源，后者需要以纤维素为主要的碳源

B．尿素分解菌能产生脲酶，纤维素分解菌能产生纤维素酶

C．两个过程中都需要梯度稀释

D．刚果红染色法也可以用于鉴定尿素分解菌

解析：选D

两种细菌的分离都用到选择培养基，分离尿素分解菌的培养基以尿素为唯一氮源，分离纤维素分解菌的培养基以纤维素为主要碳源；两种细菌能分别产生脲酶和纤维素酶；由于在样品中细菌的浓度较大，所以都要进行梯度稀释；刚果红染色法仅能用于纤维素分解菌的鉴定。

16.在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数。下面是某培养基的配方中的部分成分：NaNO3、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、H2O。在实验室里进行微生物培养时，进行的接种过程如图所示，则下列说法错误的是(

) A．此实验采用了平板划线法对微生物进行接种

B．每次划线前要对接种环进行灼烧，冷却后从上一区划线末端开始划，首尾区不重叠

C．若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则除去NaNO3成分即可

D．若用于培养纤维素分解菌，应加入纤维素粉

解析：选C

从题意可知，若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则应除去NaNO3，另外还需加入葡萄糖和尿素，分别补充碳源和氮源。

17．下列关于四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，其中正确的一组是(

)

能源

碳源

氮源

代谢类型

A.硝化细菌、乳酸菌

C．酵母菌、衣藻

硝化细菌

氧化NH3

CO2

NH3

自养需氧型

乳酸菌

分解乳酸

糖类

N2

异养需氧型

酵母菌

固定N2

糖类

N2

异养需氧型

衣藻

利用光能

CO2

NO3

自养需氧型

－

B．乳酸菌、酵母菌

D．硝化细菌、衣藻

解析：选D

乳酸菌是异养厌氧型生物，酵母菌是异养兼性厌氧型生物；乳酸菌和酵母菌的能源物质为糖类，二者不能以N2为氮源。

18．下列说法错误的是(

) A．从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，最主要的实验条件差别是保证无氧环境

B．用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少

C．提取和分离纤维素酶的过程中，为了避免外界酸和碱对酶活性的影响，需向提取液和分离液中添加缓冲溶液

D．若探究纤维素酶活性的最适温度，可设置不同的温度梯度进行空白对照

解析：选D

牛胃是一个无氧的环境，所以分离其中的纤维素分解菌与分离需氧型醋酸菌培养条件有所不同；当两个或多个细菌连在一起时，平板上只观察到一个菌落，所以计数的菌落数比活菌的实际数目偏少；探究酶活性的最适温度可设置一系列的温度梯度相互对照，其他无关变量要相同且适宜。

19．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃条件下恒温培养3 d，结果如图所示。从实验结果分析，下列叙述错误的是(

)

A．链霉素能阻止结核杆菌的生长

B．链霉素对结核杆菌比对霍乱弧菌更有效

C．链霉素对结核杆菌比对伤寒杆菌更有效

D．链霉素可以用于治疗伤寒

解析：选D

由图可知链霉素对伤寒杆菌没有抑制作用，因此不能用于治疗伤寒。

20．某种细菌菌株需要亮氨酸才能生长，但此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表格中细菌菌株类型，则配制相应选择培养基类型正确的是(

)

选项

A B C D 筛选出不需要亮氨酸的菌株

L＋

S＋

L－

S－

L－

S＋

L＋

S－

筛选出抗链霉素的菌株

L－

S－

L＋

S＋

L＋

S＋

L－

S－

筛选出不需要亮氨酸的抗链霉素的菌株

L＋

S－

L－

S＋

L－

S－

L＋

S＋

注：L代表亮氨酸，S代表链霉素；＋代表加入，－代表不加入。

解析：选B

筛选不需要亮氨酸的菌株时培养基中不需要添加亮氨酸，同时也不应该添加链霉素，以免杀死该种细菌；筛选抗链霉素的菌株时需要向培养基中添加链霉素和亮氨酸；筛选不需要亮氨酸且抗链霉素的菌株时需要向培养基中添加链霉素，但不添加亮氨酸。

二、非选择题(除注明外，每空1分，共50分) 21．(10分)某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中活菌数目，培养基配方如表：

KH2PO4

1.4 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 蛋白胨

1.0 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

1.0 g 琼脂

15.0 g (1)为了成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)，其生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的______和________。根据该培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？________(填“能”或“不能”)，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(2)统计每克土壤样品中活菌数目，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的________就能大约推测出样品中活菌数。用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为____________________________________________。

(3)在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2 mL，稀释倍数为105时，每毫升样品中的菌落数为________个。

(4)一同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是________________，为避免此种现象，应对菌液进行________。

解析：(1)尿素分解菌所需要的氮源来源于尿素，碳源来源于培养基中的葡萄糖。据表分析，蛋白胨可以为微生物的生存提供氮源，所以不能用该培养基分离尿素分解菌。(2)固体培养基上的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法可用于微生物的计数，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目能够推测样品中的活菌数。但是当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落，因此用

这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量多。(3)在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2 mL，稀释倍数为105时，每毫升样品中的菌落数＝50÷0.2×105＝2.5×107(个)。(4)在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是菌液浓度过高，为避免此种现象，应对菌液进行梯度稀释。

答案：(10分)(1)尿素

葡萄糖

不能

培养基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能选择出只分解尿素的微生物

(2)菌落数目

多

当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落

(3)2.5×107

(4)菌液浓度过高

梯度稀释

22．(8分)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

(1)该培养基中微生物所需的氮来源于____________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是_______________________________________________ ___________________________________________________________________。(4分) (3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。

若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。

解析：(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。

答案：(8分)(1)牛肉膏、蛋白胨

琼脂

(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(4分)

(3)污染

不正确

23．(10分)某同学欲利用所学习的微生物培养知识，通过实验来证明痰液中含有细菌，来倡导同学们不要随地吐痰，以下是他进行的实验内容。回答下列问题：

(1)制备供细菌生长的培养基。实验室常用牛肉膏蛋白胨固体培养基，制备该培养基的步骤是：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板，其中灭菌常用的方法是____________，在溶化之后、灭菌之前还需要调________；平板冷凝后，还需要将平板倒置，主要目的是防止__________________________。

(2)琼脂是一种从红藻中提取的多糖，在培养基中常常加入一定量的琼脂，添加琼脂的目的是______________________________________。

(3)为了使实验结果更有说服力，该同学设置了空白对照组和若干实验组，其中对照组的作用是__________________________________。(2分) (4)微生物接种的方法有稀释涂布平板法和平板划线法，其中平板划线法并不适合用于微生物的计数，其主要原因是______________________________(2分)。某同学利用稀释涂布平板法来统计样品中细菌的数目，他在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为163，则每毫升痰液样品中的细菌数是(所用稀释液的体积为0.2 mL)____________(2分)。

解析：(1)对培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌法；由于平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(2)在培养基中添加琼脂是作为凝固剂。(3)设置对照组的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。(4)平板划线法在起初划线时，微生物菌体仍集中在一起，因此，不能将菌体充分分离开，许多菌落并不是由单个菌体所形成的，因而，该方法不适合用于微生物计数。利用稀释涂布平板法计数每毫升痰液样品中的细菌数为163÷0.2×104＝8.15×106(个)。

答案：(10分)(1)高压蒸汽灭菌法

pH

皿盖上的水珠落入培养基，造成污染

(2)作为凝固剂，使液体培养基凝固为固体培养基

(3)排除实验组中非测试因素对实验结果的影响(合理即可，2分)

(4)不能将菌液中的微生物充分分离开来(2分)

8.15×106个(2分) 24．(11分)如图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。请分析回答下面的问题：

(1)本实验所需要的培养基为选择培养基，碳源为______________。

(2)实验原理是____________________________________________________________ ___________________________________________________________________。(2分)

(3)①→③重复培养的目的是_____________________________________________。

(4)⑤的菌落中大部分是降解________的微生物。

(5)⑥为________________组，⑦为________________组，设置⑥的目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(6)⑤→⑥采用________法，接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。(2分) 解析：先用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基，经过富集培养之后，将其涂布到固体平板培养基中分离培养，然后将单菌落接种到液体培养基中，才能得到纯度较高的微生物。

答案：(11分)(1)对羟基苯甲酸

(2)利用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，经富集培养，选出能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物(2分)

(3)增大分解对羟基苯甲酸微生物的比例

(4)对羟基苯甲酸

(5)对照

实验

说明通过富集培养的确得到了欲分离的目标微生物

(6)单菌落挑取

接种环在火焰上灼烧灭菌，烧红的接种环应在火焰旁冷却，同时，打开皿盖挑取菌落接种到试管中，并塞好棉塞，再把接种环在火焰上灼烧，杀灭残留物(2分) 25．(11分)酵母菌是一种真菌，与人们的日常生活密切相关，也是现代生物技术研究常用的模式生物，请回答下列有关问题：

(1)土壤中富含各种微生物，将其浸出液接种到特定培养基上，可得到酵母菌，这一过程叫做____________；不同培养基的具体配方不同，但一般都含有______________________________等营养物质。

(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，在培养酵母菌的过程中，对培养基、接种环所采用的灭菌方法分别是__________________________________。

(3)某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌(可利用空气中的N2作为氮源)和酵母菌混在了一起。请你设计实验，分离得到纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌。

①实验原理：________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。(2分) ②材料用具(略)

③主要实验步骤：

第一步：制备两种培养基，一种是________培养基，另一种是________的培养基。分别分成两份，依次标上A、A′和B、B′，备用。

第二步：分别向A、B培养基中接种________。

第三步：接种后，放在恒温箱中培养3～4 d。

第四步：分别从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的菌种，接种到A′和B′培养基中。

第五步：接种后，把A′和B′培养基放入恒温箱中培养3～4 d。

④回答问题：

a．第四、五两个步骤的目的是____________________________________________。

b．在操作中，为保证无杂菌感染，实验中应采用的主要措施有________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。(2分) 解析：(1)从自然环境中获得菌种的过程是微生物的分离过程，通常用含有特定物质的选择培养基，该培养基中除含有特殊物质外，一般都包含水、无机盐、碳源、氮源。(2)微生物培养前需对培养基进行高压蒸汽灭菌，而接种环应用火焰灼烧灭菌。(3)圆褐固氮菌为自生固氮菌，可以利用空气中的N2合成自身所需要的含氮有机物。酵母菌为真菌，属于真核生物，不能自己合成有机物，但能在含有青霉素的培养基上生长；青霉素可抑制细菌、放线菌等原核生物细胞壁的合成，也就可以抑制它们的生长，但不会抑制酵母菌的生长，所以需要配制无氮培养基和含青霉素的培养基来筛选这两种微生物，其他条件均应完全相同，如接种混合菌量、培养温度、培养时间等。要获得较纯的菌种，可以进行多次筛选。操作过程要保持无菌，培养基进行高压蒸汽灭菌，接种环进行火焰灼烧灭菌，接种应在酒精灯火焰附近进行。

答案：(11分)(1)酵母菌的分离

水、无机盐、碳源、氮源

(2)高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌

(3)①圆褐固氮菌是自生固氮菌，能在无氮培养条件下生长繁殖，而酵母菌不可以；青霉素不影响酵母菌等真菌的生长繁殖，但会抑制圆褐固氮菌的生长繁殖(2分) ③无氮

加青霉素

混合菌

④a.获得纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌

b．对培养基进行高压蒸汽灭菌；接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌；接种过程在酒精灯火焰附近进行(2分)