课题3　血红蛋白的提取和分离教学内容

专题5课题3《血红蛋白的提取和分离》

【学习目标】

1．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法 2．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

【知识链接】

血红蛋白由四条链组成，含两条α链和两条β链，其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈现红色。

【新知预习】

一、基础知识

1．凝胶色谱法

(1)概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据____________的大小分离蛋白质的有效方法。

(2)原理：大多数凝胶是一些微小的________球体，内部有许多贯穿的通道，当____________不同的蛋白质通过凝胶时，________________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程________，移动速度较慢；而______________的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程________，移动速度较快。____________不同的蛋白质因此得以分离。

2．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的________对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种________溶解于水中配制而成。调节________的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

3．电泳

(1)概念：是指_______粒子在电场的作用下发生_______的过程。

(2)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的________下，这些基团会带上____________。在电场的作用下，这些________分子会向着与其所带电荷________的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子________的差异以及________的大小、________不同，使带电分子产生不同的________，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和______________电泳。

二、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、粗分离、纯化和纯度鉴定。

1．样品处理和粗分离

(1)红细胞的洗涤：采集血样，____________离心，吸取血浆后加________洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是除去________，以利于后续步骤的分离纯化。

(2)血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞依次加入蒸馏水至______体积，再加40%体积的______，置于____________上搅拌10 min，使红细胞吸水涨破，血红蛋白释放出来。

(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min。离心后试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的________，第2层为白色薄层固体，是____________的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是________的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去____________层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

(4)透析：取1 mL的血红蛋白溶液装入________中，将________放入盛有300 mL的物质的量浓度为__________mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中________________的杂质)。

2．纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工________→安装色谱柱。

(2)凝胶色谱柱的装填。因为干的凝胶和________________的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶(Sephadex G—75)。“G”表示凝胶的________，膨胀程度及分离范围，75表示________值，凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成________悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻________色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有________存在。

(3)样品的加入和________。

3．纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是________________________________________________________________________电泳。

三、操作提示

1．红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；________离心。

2．凝胶的预处理：沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的________和空气。

3．色谱柱的装填：装填尽量________，降低颗粒间隙；无________；洗脱液不能断流。

4．色谱柱成功的标志：红色区带________地移动。

思考：与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

【课堂探究】

类型一

蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析

相对分

直径大小

子质量

大于凝胶颗大

粒空隙直径，被排阻在外面

小于凝胶颗粒空隙直径，小

可以进入颗粒内部

则扩散进入凝胶颗粒

垂直向下移动，无规

运动方式

速度

路程

运动

运动

洗脱次序

例1：凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是( ) A．蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小 B．蛋白质相对分子质量的大小

C．蛋白质所带电荷的多少 D．蛋白质溶解度的大小

例2：用凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是(

) A．改变蛋白质分子通过凝胶的路径 B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度

C．将酶或细胞固定在凝胶中 D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度

类型二

电泳方法比较

电泳方法

原理

琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理

特点

②电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定

在一定浓度范围内，聚丙烯酰胺对热稳定性强，可以用检测仪直接测定

测定蛋白质的相对分子质量常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为例3：下列关于电泳的说法，哪一项是正确的(

) A．电泳是指不带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程

B．电泳的过程要在一定的pH下，所以一定要使用缓冲液

C．交联葡聚糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法

D．聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溶液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，电泳的迁移率主要取决于分子所带电荷的多少和相对分子量的大小

例4：下列各项中，不是电泳使样品中各分子分离原因的是( ) A．带电性质差异

B．分子的大小 C．分子的形状 D．分子的变性温度

类型三

血红蛋白的提取和分离应注意的事项

1．样品处理

(1)最好用新鲜的血液。切记要在采血的容器内预先加入_____________________，血样取回后，马上进行_________。

(2)洗涤红细胞时离心速度与离心时间十分重要，离心转速________，时间___ _____，否则____________________，达不到分离的效果。

(3)红细胞要重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。

(4)过滤血红蛋白时，用滤纸过滤除去脂溶性沉淀，然后在________________中分离出血红蛋白水溶液层。

2．凝胶色谱柱的制作

(1)凝胶色谱柱的直径不宜过大，直径过大，易造成________________________，样品的稀释浓度过大。因此，选择直径不超过2 cm的色谱柱。凝胶色谱柱的________与分离度

有关，一般不超过1 m。

(2)凝胶颗粒需在蒸馏水或洗脱液中膨胀，也可采用____________________。加

入________________，既可以使凝胶快速膨胀，又可以杀死微生物，排除凝胶料中的空气。

(3)在装填凝胶柱时，要尽量_______ _____，以____________________________；要注意不得有____________存在，气泡会搅乱________________________________，降低分离效果；同时在凝胶色谱操作中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生以上现象，凝胶色谱柱____________________。

3．蛋白质的分离

(1)滴加样品时，吸管管口贴着________________________，不要破坏凝胶面。

(2)洗脱过程中，要注意保持______________________ ______，在分离过程中，如果________________________移动，说明色谱柱制作成功。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。

例5：下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是( ) A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞

C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液

例6：关于凝胶色谱柱的装填，不正确的是(

) A．交联葡聚糖凝胶(G－75)中“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，“75”表示凝胶得水值

B．色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装

C．用300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h D．凝胶用自来水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液

类型四

实验结果分析与评价

项目

血液样品

的处理

①分层明显→_______________________

②分层不明显原因：洗涤次数少，未能除去__________________；分析

离心速度过快和时间过长

凝胶色谱

①_______________________→直接检查是否装填得均匀

柱的装填

②加入大分子有色物质，_______________________→装填成功

①血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，_________________→分血红蛋白

离成功

的分离

②__________________________________________________→分离效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关

例7：利用哺乳动物的血液提取血红蛋白时，每一步操作都有严格的要求，以下是有关该实验操作的一些说法，正确的是( ) A．分离血红蛋白时的离心速度要比分离红细胞时快

B．在凝胶柱中加入蓝色葡聚糖，色带较宽，边缘平整，说明凝胶装填成功

C．装填凝胶时，要将凝胶一次性快速倒入色谱柱，用力摇动色谱柱，使凝胶装填均匀

D．洗脱时待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管就可以收集到没有杂质的血红蛋白

巩固练习：

1．凝胶色谱法(分配色谱法)原理是分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程长，流动慢；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程短，流动快。 ( ) 2．红细胞的洗涤如果分层不明显，肯定是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。( ) 3．缓冲液由弱碱和相应的强酸弱碱盐组成，其作用是抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而( ) 4．红细胞的洗涤中加入柠檬酸钠有防止血液凝固，低速、短时离心是防止白细胞沉淀，缓慢搅拌是防止红细胞破裂释放出血红蛋白保持pH稳定。 。 ( ) 5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的

微生物和排除凝胶内的空气。 ( )