课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段全国优秀课堂实录

凤鸣中学自主学习导学设计

年级

高二

__ 科目

生物____ 主备教师

张入花

协作教师

_____申海萍_____

课题

多聚酶链式反应扩增DNA片段

重点：PCR的原理和PCR的基本操作。

难点：PCR的原理。

教具使用：

导

学

设

计（

）

操

作

卡

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导学卡

学习目标

1．会根据DNA的结构知识分析DNA复制的原料、条件。会分析体外DNA复制的原料、条件即 PCR的原理。

2．回根据以上原理设计PCR技术的基本操作程序，知道注意事项。

学习任务

情境链接：DNA分子的基本组成单位是什么？请在下面空白处画出DNA分子基本单位的简图：

一、PCR原理：

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1、细胞内DNA复制条件分析：

条件

模板

原料

酶

能量

引物

组分

作用

2、DNA的复制过程: （1）解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

1

（2）引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

（3）DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。 注：DNA的合成方向（图5-6）

3、DNA分子复制的人工控制

①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为 _____________ ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为 _____________

PCR利用了_________________原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控________的仪器.

高温解决了__________的问题，但是，又导致_________________的新问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了上述矛盾，促成了PCR技术的自动化.

体外进行DNA复制时，直接参与的组分：_____________、____________、________________、_________________，同时PCR反应需在一定的________中进行，通过控制________温度DNA复制在体外反复进行。

4、.细胞内复制DNA和PCR的不同点

（1）在解旋酶作用下边解旋边复制，而PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过_______使双链______解开

（2）PCR过程需要的引物是_________________单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸; （3）PCR过程中使用的DNA聚合酶是耐________的。

二、

PCR的反应过程

1、PCR的反应过程

PCR一般经历_____多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤_______、_______和______。

2

变性

复性

延伸

①变性

②复性

③延伸

2、PCR 循环的结果

①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为 参与反应，并且由_______延伸而成的DNA单链会与_________结合，进行DNA的延伸; ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于___________之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈______扩增; 三、PCR 的实验操作

PCR反应体系：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

（1）设备及用具

1、PCR仪：实质上一台能够自动调控温度的仪器

2、微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

（2）实验操作步骤

1、准备：______________________________________________________________ 2、移液：______________________________________________________________ 3、混合：______________________________________________________________ 4、离心：_______________________________________________________________ 5、反应：______________________________________________________________ 如果没有PCR仪，怎么办？

注意事项：

1、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中所用仪器、缓冲液、蒸馏水等在使用前必须进行__________________。

2、缓冲液和酶应分装成小份，_______低温保存。使用前放在________上缓慢融化。

3、每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

4、所有的成分都加入后，______离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液___________，再离心处理，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中

3

进行反应。

四、理论上DNA扩增数目的计算

n一个DNA分子，复制n次， DNA为2

五、实验中DNA含量的测定

1 、原理：

2 、过程

①稀释

②对照调零 ③测定 ④计算DNA含量（

g/mL ）＝50 x (260nm的读数）x 稀释倍数

六、实验小结

PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温(

),在（

）的作用下,以

（ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。

如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。

学习疑点

训练卡

1. 引物的作用是（ ）

A. 打开DNA双链 B. 催化合成DNA子链

C. 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始复制 D. 提供模板

2. DNA复制过程中的前提是（ ）

A. 获得引物 B. 催化合成DNA子链 C. 解旋 D. 4种脱氧核苷酸

3. PCR操作中，从第二轮循环开始扩增的DNA片段（ ）

A. 固定长度 B. 一端固定 C. 都不固定 D. 不能确定

4. 从第二次循环开始，复制的DNA片段呈（ ）扩增。

A. 直线 B. 指数 C. 对数 D. 不变

5. 有关PCR的叙述中正确的是（ ）

A. PCR反应所需要的引物只是RNA B. PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸

C. PCR反应所需要的酶在60℃会变性

D. PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行

6. 下列操作过程的叙述中错误的是（ ）

A. PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B. PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

C. PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存

D. 在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换

4

7. PCR利用了DNA的（ ）原理，来控制DNA的解聚和结合

A. 特异性 B. 稳定性 C. 热变性 D. 多样性

8. 假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，在5次循环后，反应物中大约有（ ）个这样的DNA片段。 A. 8 B. 16 C. 32 D. 64 9. 在PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，经过一次循环后，含引物I的DNA单链占DNA总链数的（ ） A. 1/2 B. 1/4 C. 1 D. 1/8 10. PCR的每次循环都可以分为三步，按循环的顺序排列是（ ）

A. 变性、延伸、复性

B. 变性、复性、延伸

C. 复性、变性、延伸

D. 延伸、变性、复制

11. DNA复制时，合成DNA新链之前必须合成（ ）

A. DNA引物 B. RNA引物 C. 新的脱氧核苷酸 D. 核苷酸

12. （1）PCR与生物体内的DNA复制有何区别？

（2）PCR每次循环都可分为_____、_____和_____三步。

（3）__________的发现和使用大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向__________。

（4）PCR通过控制__________来控制双链的_____与_____。

（5）PCR反应需要一定的缓冲溶液中提供_____分别与两条模板结合的__________、_____种脱氧核苷酸、__________的DNA聚合酶。

（6）从第二轮循环开始，DNA聚合酶只能特异的复制_____的DNA序列，使这段_____的序列呈指数扩增。

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