复习与测试第二课时教案

专题2 微生物的培养与应用

2.1 微生物的实验室培养

一、培养基的分类：

1、按物理性质分：液体培养基用于工业或生活生产，固体培养基用于微生物的分离和鉴定。

2、按成份分：人工合成培养基用于微生物的分离鉴定。天然培养基常用于实际工业生产。

3、按用途分：可将培养基分为选择培养基和鉴别培养基。

选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。以纤维素为唯一碳源选择培养基，可以分离分解纤维素的微生物；分离产生蛋白酶的微生物，用以蛋白质为唯一氮源培养基。不加入有机碳源可以选择培养自养微生物。培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物。

鉴别培养基：是在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物。

二、培养基的成分：

培养基的化学成分包括碳源、氮源、水、无机盐、生长因子等。

（1）碳源：需要量最大，如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。最常利用的碳源是糖类。

自养微生物：利用CO2或碳酸盐作为碳源（以无机碳源作为主要碳源）

（2）氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如无机氮源：N2、NH3、NO3、NH4；有机氮源：蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨等。能把氮气作为氮源只限于固氮生物如固氮菌、某些放线菌和藻类等。常利用的氮源是氨盐、硝酸盐。

（3）微生物之所以需要补充生长因子，是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。

（4）培养基还要满足微生物生长对以及氧气的要求。

微生物

碳源

氮源

能源

-+PH，特殊营养物质大肠杆菌

糖类、蛋白质蛋白质等

等有机物

硝化细菌

根瘤菌

固氮蓝藻

糖类

NH3氧化

有机物

CO2

糖类等有机物

NH3

N2

N2

CO2

光能

例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。

三、无菌技术

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

1、消毒与灭菌的区别 ①消毒：指使用较为温和的物理或化学仅杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法、巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体，如牛奶）还有化学药剂（如酒精、氯气等）消毒、紫外线消毒。

②灭菌：则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法。

2、常用器具的灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具、培养皿等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是

高压蒸汽灭菌锅。

3、实验操作

（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。

①倒平板：待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种. ②为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基。

③平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置的作用是既使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止培养皿盖上的水珠落入培养基造成污染。

④培养基的制作是否合格？ 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

（2）纯化大肠杆菌

①微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

②平板划线法——通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的菌落。

a.该方法操作步骤中无菌操作：接种环灼烧，试管口通过火焰，在火焰旁进行试验。操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，目的是及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。

b.该方法关键步骤：从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。

③稀释涂布平板法——是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释浓度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

a.该方法步骤中无菌操作：将涂布器酒精浸泡后在火焰上引燃，涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。

（4）菌种的保存

①临时保藏方法：将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培

养基上转移到新鲜的培养基上。这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

②长期保藏方法：将菌液转移到甘油瓶中与甘油充分混匀，放在－20℃的冷冻箱中保存。

2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、统计菌落数目

1、测定微生物数量的常用方法有显微镜直接计数法和活菌计数法（稀释涂布平板法）。

（1）显微镜直接计数法：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。缺点：不能区分死菌与活菌，结果偏大。

（2）稀释涂布平板法：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌；所以又称之为活菌计数法。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30－300的平板进行计数，并取平均值。统计结果偏低，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

公式：每克样品中的菌落数=（C/V）M，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数。

二、土壤中分解尿素的细菌的分离实验设计

（1）土壤取样：从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。

（2）样品的稀释：土壤中各类微生物的数量不同，为获得各种微生物，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30－300之间的平板，如测定土壤中细菌的数量，一般选用10、10、102456倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用释；测定真菌的数量，一般选用10103、104、105倍稀34、10、10倍稀释。

（3）微生物的培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30－37℃ 1～2天。放线菌25－28℃ 5～7天。霉菌25－28℃ 3～4天。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征：形状、大小、隆起程度、颜色。

三、细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基PH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

2.3 分解纤维素的微生物的分离

一、纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，

即C1酶、Cｘ酶、葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

二、纤维素分解菌的筛选

（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

（2）原理：在含有纤维素的培养基中加入刚果红，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

三、分离分解纤维素的微生物的实验流程

（1）土壤取样（选择富含纤维素的环境）→选择培养（增大分解菌含量，根据样品中目的菌株数量的多少来确定是否需要该步骤）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。

（2）刚果红染色法种类：一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

（3）初步筛选出纤维素分解菌，还需要进行发酵产生纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后产生葡萄糖的进行定量的测定。

习题答案：

1、（2014年新课标1）

（1）纤维素二糖 葡萄糖

（2）红 透明圈

（3）不能 该培养基是液体培养基

不能 该培养基中没有纤维素

2、（2014年新课标2）

（1）检测培养基平板灭菌是否合格 3.8x10

（2）灼烧 将聚集的细菌逐步稀释以便获得单个菌落

7（3）B （4）溶解氧 营养物质

4、（2013全国课标卷II）

（1）平板划线 稀释涂布平板

（2）稀释涂布平板

（3）敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比A弱 耐药性

（4）A

6、（2011新课标卷）

（1）原油 选择

（2）平板划线 稀释涂布平板

（3）强 干热灭菌法 高压蒸汽灭菌法 火焰