课题3　血红蛋白的提取和分离课堂实录

专题5课题3 血红蛋白的提取和分离

[课题目标]：尝试对血液中血红蛋白的提取和分离；体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法；了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理。

[课题重点]：凝胶色谱法的原理和方法

[课题难点]：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【基础梳理】

一、凝胶色谱法

1、概念：也称做

；其用途是根据

分离蛋白质。

2、原理

（1）由

构成的凝胶，内部有许多贯穿的的

。

（2）当

不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量

的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

，而相对分子质量

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

，从而使

不同的蛋白质分子得以分离。

二、缓冲溶液

1、作用：在一定范围内，抵制

的

对溶液pH的影响，维持pH

。

2、配制：由

种缓冲剂溶解于

中配制而成，通过调节缓冲剂的

就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

三、电泳

1、概念：指

在电厂的作用下发生

的过程。

2、原理：在一定的

下，

、

等生物大分子的可解离基团会带上

或

，在

的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷

的电极移动。

3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子

的差异及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中

的分离。

4、方法：常用的电泳方法有

和

。测定蛋白质分子量时通常使用

。

四、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和纯度鉴定。

1、样品处理、

(1)红细胞的洗涤：目的是

。分离时采取

，直至上清液中没有

，表明红细胞已洗涤干净。

(2)血红蛋白的释放：在

和

的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液：把

离心后，将试管中的液体用

过滤、除去

，于

中静置片刻后，分离出下层的

。

（4）透析

①

方法：将血红蛋白溶液装入

，将

放入一定量适宜浓度的

中，透析

h。

②

目的：将

的杂质除去。

③

原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：

(1)凝胶色谱柱的制作。

(2)凝胶色谱柱的装填

①材料：本实验使用的是

。

②方法：凝胶用

充分溶胀后。配成

，一次性

倒人色谱柱内。不能有

存在；不能发生

流干露出凝胶颗粒的现象。

(3)样品的加入和洗脱

①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的

缓慢下降到与

平齐，关闭出口。

b、加样：用

小心地将1mL透析后的样品加到

的顶端，注意不要破坏

。

c、加样后：打开下端出口，使样品渗入

内。

②洗脱：加入

，打开下端出口，进行

。

4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是

。五、操作提示

1、红细胞的洗涤：

、

与

十分重要。

过少，无法除去血浆蛋白；

过高和

过长会使

等一同沉淀，达不到分离效果。

2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在

中膨胀，可以将加入其中的

用

加热，加速膨胀。

3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的

，降低

。

4、蛋白质的分离：如果红色区带

地移动，说明色谱柱制作成功。

【探究归纳】

一、人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?

二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水?

三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?

四、凝胶色谱法的原理归纳

【典例导析】

类型一

凝胶色谱法分离蛋白质

【例l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是

，原因是

。

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由

替代。

（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是

。

（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体

(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是

。

【提能演练】

一、选择题

1、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是

(

) A、改变蛋白质分子通过凝胶时的路径

B、吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度

C、将酶或纽胞固定在凝胶中

D、与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度

2、下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是

(

) A、层析柱高

B、层析柱的直径

C、缓冲溶液

D、样品的分布

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是

(

) A、蛋白质分子所带的电荷

B、蛋白质分子的形状

C、蛋白质分子的相对分子质量

D、缓冲溶液的pH 4、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是

A、要在采血容器中预先加人抗凝血剂柠檬酸钠

B、取血回来后，马上进行高速长时问离心

C、将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌

D、重复洗涤直到上清液呈红色为止

5、下面说法不正确的是

(

) A、在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D、透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

6、蛋白质的提取和分离分为哪几步

(

) A、样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

B、样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D、样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

7、洗涤红细胞时，离心所采用的方法是

A、低速长时间离心

B、低速短时间离心

C、高速长时间离心

D、高速短时间离心

8、凝胶色谱法分离蛋白质中使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(Sephadex G一75)，其中G、75的含义为

(

) A、G表示凝胶的使用量，75表示加25 g水

B、G表示凝胶的交联程度，75表示需加热到75℃

C、G表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7、5g D、G表示凝胶的膨胀体积,75表示每克凝胶膨胀时体积可达75cm3 二、非选择题

9、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图I)和洗脱(图Ⅱ)示意图，请据图回答下列问题。

(1)在加样示意图中，正确的加样顺序是

。

(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是①

。②贴着管壁加样、③

。(3)等样品

。时，才加入缓冲液

。

待

接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每

mL收集一管，连续收集。

10、(2008·山东高考)科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。

(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的

、大小及形状不同，在电场中的

不同而实现分离。

(2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供

和

。

(3)分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种培养基中菌落的

，确定该蛋白质的抗菌效果。

(4)细菌培养常用的接种方法有

和

。实验结束后，对使用过的培养基应进行

处理。