课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段评课稿

《课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段》-----教案

姓名：徐龙涛 单位：黑龙江省浩良河化肥厂学校 联系电话：15145835789 详细通讯地址：黑龙江省浩良河化肥厂学校 邮编：153103

【课题目标】

知识与技能：1.理解PCR的原理和反应过程。

2.讨论PCR的应用

过程与方法：在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件。

情感态度价值观：通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神。

【教学重点】

PCR的原理和PCR的基本操作

【教学难点】

PCR的原理

【教学方法】

启发式教学、讨论式、自主学习等

【教学工具】

多媒体课件

【教学过程】

一、引入

情境创设：DNA案件侦破视频剪辑

教师引导：当我们看完视频我们有什么感受？

人类基因组计划、刑侦破案、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？在本课题的学习中我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

二、新课

课上探究：

1、PCR与生物体DNA复制有何区别？

2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？

基础知识：

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1.细胞内DNA复制条件分析：

条件

模板

原料

酶

能量

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

DNA聚合酶

ATP 作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

1

引物

RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

2.细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。

3.DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4．PCR的反应过程

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

2．实验操作

1. PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

2.实验操作步骤

3. 按照PCR反应体系配方配制反应液；

（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

2 变性

复性

延伸

（3）将微量离心管放到PCR仪中；

（4）设置PCR仪的工作参数。

（5）DNA在PCR仪中大量扩增。

2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3．实验注意事项

1.避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

2.缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。

4.混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

5．PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。

6．PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。

特别提示：①PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染。

②在操作中离心约10s，目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。

4．结果分析与评价

1.反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

2.将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

3.计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

三、巩固练习（课件）

四、课堂总结

五、板书设计（略）

多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

DNA的变性和复性受温度影响

变性

复性

延伸

移入离心管

放入PCR 计算

PCR过程

操作步骤

配制PCR反应体系

设置工作参数

调零

DNA扩增

测定含量

稀释

片段测定并读数

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