课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案

课题3

血红蛋白的提取和分离（教学设计）

【课题目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【课题重点与难点】

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【导学诱思】

思考1：分离生物大分子的基本思路是什么？

思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？

思考3：

高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？

思考4：人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

教学过程：

一、复习引入

蛋白质小知识：

1、含量：占细胞干重的50％以上，是细胞中含量最多的有机化合物。

2、组成元素：C、H、O、N 3、基本单位：氨基酸

4、分子结构：

5、相对分子质量：高分子化合物

二、新课讲授

1、蛋白质提取与分离的依据－－

蛋白质的物理化学性质差异：

（1）分子的形状、大小

（2）电荷性质和多少

1

（3）溶解度 （4）吸附性质

（5）对其他分子亲和力 2、方法及原理

方法

原理

根据相对分子质量的大小分离蛋白质

各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同

凝胶色谱法

电泳法

（一）凝胶色谱法（分配色谱法）

1、

概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。

2、凝胶

性质：微小的多孔球体

本质：多糖类化合物

实例：葡聚糖、琼脂糖

3、原理

当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

4、凝胶色谱法分离蛋白质过程

混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

（二）电泳

1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

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2、原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

3、类型：

琼脂糖凝胶电泳、

聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳

应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定

原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。

SDS：消除净电荷对迁移率的影响。

（三）缓冲溶液－－洗脱剂

1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。

2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。

3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

提问：还记得人体血液中的缓冲液吗？

H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4 3

提问：在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？

本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。

四、实验操作－－实验步骤

（一）样品处理和粗分离

1、

红细胞的洗涤

问题：刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？

加入抗凝血剂，

防止血液凝固。

问题：怎样洗涤？ 低速短时间离心 加生理盐水

2、血红蛋白的释放

问题：加蒸馏水和甲苯的作用是什么？使红细胞吸水破裂；溶解细胞膜；释放出血红蛋白。

问题：快速充分搅拌10min的作用是什么?

使红细胞加速破裂；

3、分离血红蛋白溶液

过程：高速离心－滤纸过滤－漏斗分液

4、透析

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透析的目的是什么？去除血红蛋白中的小分子杂质

【课堂小结】

【布置预习】

（二）纯化－－凝胶色谱操作

（三）纯度鉴定

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