复习与测试教学设计第二课时

选修一知识小节

酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。

温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20oC 左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵时一般将温度控制在

18—25oC。在葡萄酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。在发酵过程中，随着酒精度数的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈现深红色。在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。

到了冬天，酵母菌形成孢子，进入休眠状态。

醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。在变酸的酒的表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖而形成的。醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为 30—

35oC。

发酵瓶要清洗干净，用体积分数为

70%的酒精消毒，或用洗洁精洗涤。

葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约

1/3

的空间。

果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条

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件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。检测时，先在试管中加入发酵液 2mL，再滴入物质的量浓度为

3mol/L

的

H2SO43 滴。振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液 3 滴，振荡试管，观察颜色的变化。

琼脂是一种从红藻中提取的多糖。琼脂在

98oC

以上熔化，在

44oC

以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基。其中，配制成的液体状态的基质称为液体培养基，配制成的固体状态的基质称为固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基，它是实验室中最常用的培养基之一。

微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。

虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐。

牛肉膏：碳源、氮源、磷酸盐和维生素。

蛋白胨：碳原、氮源和维生素。

Nacl：无机盐。

H2O：氢元素、氧元素。

培养基还需要满足微生物生长对

PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的 PH 调至酸性，培养细菌时需将 PH 调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。

获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：

(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

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消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

煮沸消毒法。在 100oC 煮沸 5—6min 可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则使用巴氏消毒法，在

70--75oC 煮

30min

或在 80oC 煮

15min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。此外，人们也常使用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等。

使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具，直接

在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。

将灭菌物品入干热灭菌箱内，在

160—170oC

加热

1—2h

可达到灭菌的目的。能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。

将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，继续加热使锅内的气压逐步上升，温度也随之升到 100oC 以上。

为达到良好的灭菌效果，一般在压力为

100KPa，温度为

121oC

的条件下，维持

15—

30min。

实验室里还用紫外线或化学药物进行消毒。例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射

30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液。可以加强消毒效果。

制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：(1)计算。(2)称量。牛肉膏比较

3

黏稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速。称后要及时盖上瓶盖。(3)溶化。将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中，不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水到 100mL。(4)灭菌。将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在压力为

100KPa，温度为

121oC

的条件下，灭菌

15—30min。将培养皿用几层旧报纸包紧，5—8 套培养皿作一包，包好后放入干热灭菌箱内，在

160—170oC 下灭菌

2h。(5)倒平板。待培养基冷却至

50oC

左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法。虽然这些技术的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。

微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

平板划线操作：(1)将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。(2)在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。(3)将试管口通过火焰。(4)将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。(5)将试管口通过火焰，并塞上棉塞。(6)左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿

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盖。注意不要划破培养基。(7)灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。

稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。

系列稀释操作：(1)将分别盛有

9mL

水的 6 支试管灭菌，并按

101

—106

的顺序编号。(2)用移液管吸取

1mL

培养的菌液，注入

101

倍稀释的试管中，用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。(3)从

101

倍稀释的试管中吸取

1mL

稀释液，注入

102

倍稀释的试管中，重复第 2 步混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。

注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火

焰

1—2cm 处。

涂布平板操作：(1)将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。(2)取少量菌液(不超过

0.1mL)，滴加到培养基表面。(3)将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 8—10s。(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。

注意：1.将涂布器末端浸在盛有体积分数为 70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。2.操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入

37oC

恒温箱中，培养

12h

和

24h

后，分别观察并记录结果。

为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏。对于频繁使用的菌

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种，我们可以采用临时保藏的方法。首先，将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落成长后，将试管放入

4oC 的冰箱中保藏。以后每 3—6 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。但是，这这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在-20oC

的冷冻箱中保存。

在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

实验室中微生物的筛选，也应用了同样的原理，即人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、PH 等)，同时抑制或阻止其它微生物生长。

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

稀释涂布平板法。常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在

30—300

的平板进行计数。

值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。除了上述的活菌计数法外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响。提高实验结果的可信度。

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样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在

30—300 之间、适于计数的平板。

测定土壤中细菌的数量，一般选用

104、105

和

106

倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用

103、104

和

105

倍稀释；测定真菌的数量，一般选用

102、103

和

104

倍稀释。

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一oo般在 30—37C

的温度下培养

1—2d；放线菌一般在

25—28C

的温度

下

5—7d，而霉菌一般在 25—28oC 的温度下培养 3—4d.在本实验中，我们可以每隔

24h

统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)、同种微生物表现出稳定的菌落特征。这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH 升高。因此，我们可以通过检测培养基 PH 的变化来判断该化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果 PH 升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该细菌能够分解尿素。

细菌的数目还可以通过滤膜法来测定（以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例）。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。

胡萝卜素的化学分子式中包含多个碳碳双键，根据双键的数目可以将胡萝卜素划分为α、β、γ三类。β—胡萝卜素是其中最主要的组

成成分。一分子的β-胡萝卜素在人或动物的小肠、肝脏等器官被氧化成两分子的维生素

A，因此，胡萝卜素可以用来治疗因缺乏维生

素 A 而引起的各种疾病，如夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等。胡萝卜素是橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于

乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。

工业生产上，提取天然β—胡萝卜素的方法主要有三种：一是从植物中提取，二是从大面积养殖的岩藻中获得，三是利用微生物的发酵生产。

用做溶剂的有机物分为水溶性和水不溶性两种。乙醇和丙酮能够与水混溶，是水溶性有机溶剂；石油醚、乙酸乙脂、乙醚、苯、四氯化碳等不能与水混溶，称为水不溶性有机溶剂。

萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。此外，还需要考虑萃取效率，对人的毒性、是否易燃、有机溶剂是否能从产品中完全除去、会不会影响产品质量等问题。

萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件的影响。一般来说，原料颗粒小，萃取的温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。

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萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧、爆炸。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。在浓缩之前，还要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。

新鲜的胡萝卜含有大量的水分，在干燥时要注意控制温度，温度太高，干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。

将提取的胡萝卜素粗品通过纸层析进行鉴定，鉴定方法如下。在

18cm×30cm 滤纸下端距底边 2cm 处做一基线。在基线上取 A、B、C、

D 四点，用最细的注射器针头分别吸取 0.1—0.4mL 溶解在石油醚中的标准样品和提取样品，在

A、D

和

B、C

点上点样。点样应该快速细致，在基线上形成直径为 2mm 左右的圆点，每次点样后，可用吹风机将溶剂吹干，注意保持滤纸干燥。等滤纸上的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于装有 1cm 深的石油醚的密封的玻璃瓶中。等各种色素完全分开后，取出滤纸，让石油醚自然挥发后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。看看萃取样品中是否也出现了对应的层析带，与标准样品的有什么区别，并分析产生区别的原因。

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