课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计(第一课时)

专题五课题3教案

课题

教

学

目

标

教学

重点

教学

难点

课前

准备

教学环节（内容）

课题3 血红蛋白的提取和分离

解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理

尝试对血液中的血红蛋白的提取和分离

体验从复杂体系中提取大分子的基本过程和方法

凝胶色谱法的原理和方法

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

学案

课堂活动

个性化设计

导言：

学过DNA的提蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的取之后再继有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识续蛋白质的和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取提取，学生能蛋白质呢？

够更深刻地新课：

理解生物大分子提取的一．基础知识——蛋白质提取和分离的原理

方法

（一）分离生物大分子的基本思路

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化

学性质的生物大分子。

（二）蛋白质分离和提取的原理

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、

所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他

分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

（三）蛋白质分离和提取的方法

指导学生阅1.凝胶色谱法（又叫分配色谱法）

读教材，自主组成：多糖类化合物构成，如葡聚糖、琼脂糖

学习蛋白质一些微小的多孔球体，内含许多贯穿的凝胶：结构：

的分离和提通道，具多孔的凝胶就叫分子筛。

取的方法

概念：根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利

用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行

分离。

原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流

动快；

小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流

动慢。（如图5—13 a）

过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流

动慢→收集大分子→收集小分子（如图5—13

b）

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋

白质分子的差速流动。

缓冲溶液——洗脱剂

①组成：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。

如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等

②配制：调节酸和盐的用量，可配制不同pH

的缓冲液。

③作用：在一定的范围内，抵制外界酸和碱对

溶液pH的影响，维持

pH基本不变

本课题所选用的缓冲溶液是磷酸缓冲液，其目

的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证

血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)

和科学研究(活性) 简单介绍电2.电泳法

概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离

类型：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙稀酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。

作用：测定蛋白质分子量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。

SDS作用机理: SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子

二．实验操作——血红蛋白的提取和分离

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定

1.样品处理

思考：1.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中最好用哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白丰富，便于提取血红蛋白。

2.血液的组成是什么？

血浆和血细胞

3.血细胞中哪种细胞的数量最多？该细胞中含量最多的化合物是什么？

红细胞、血红蛋白（占红细胞体积的90%左右）

泳法的原理，学生了解即可

指导学生学习血红蛋白提取和分离的实验步骤

问题驱动学生学习血红蛋白的结构和功能

4.该化合物有什么样的结构和功能？

2个α—肽链

结构

2个β—肽链

血红蛋白

4个亚铁血红素基团

作用：亚铁血红素使血液呈红色，每个肽

链环绕一个亚铁基团，此基团可携

带一个分子O2和一个分子CO2

（1）选材：哺乳动物的红细胞

（2）样品处理

目的：去除杂蛋白，以利于血红蛋白的

红细胞的洗涤

分离和纯化

过程：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→

吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生

理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短

时离心→吸出上清液→反复洗涤直

至上清液无黄色

注意：洗涤次数不能太少，低速短时离心。如果要

高速长时离心，会使白细胞和淋巴细胞等一

同沉淀，达到分离的效果。

方法：吸水涨破

血红蛋白的释放

操作：洗好的红细胞→加蒸馏水到原有血

液体积→加40%体积的甲苯→搅拌

器充分搅拌10min→红细胞破裂，

释放血红蛋白

指导学生阅读教材和学案，明确样品处理的步骤和注意事项以落实教学重点

方法：离心分离

分离血红蛋白溶液

操作：红细胞破碎混合液→中速长时离

心（2000c/min×10min）之后

分层（如图）→滤纸过滤除去脂质

→分液漏斗分离出血红蛋白

无色透明甲苯层

白色薄层固体

红色透明液体

红细胞破碎物沉淀

2.粗分离——透析

目的：除无机盐离子和小分子有机物质

引导学生回

忆渗透作用

原理：半透膜的选择透过性。大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

的知识，迁移

操作：1ml血红蛋白溶液→装入透析袋→放入300ml 学习透析

20mmol/L PH=7的磷酸缓冲液中→透析12h

3.纯化——凝胶色谱操作

（1）制作凝胶色谱柱

①取长40CM，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平

②底塞制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端

③顶塞制作：打孔→安装玻璃管

④组装：将①②③按相应的位置组装成一个整体

⑤安装其他附属结构

（2）凝胶色谱柱的装填

材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液

G表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围

75表示凝胶得水值的10倍。

步骤：

阅读教材，对照图文学习制作凝胶色谱柱

步骤

操作要求

①

固定色谱柱

色谱柱垂直固定在支架上

②

计算称量凝胶

根据色谱柱体积计算凝胶用量

③

配制悬浮液

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

④

装填悬浮液

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

⑤

洗涤平衡

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h

注意事项：

1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙

2.配制悬浮液时，沸水浴法时间短，还能去除微生物和气泡

3.不得有气泡存在。气泡会扰乱洗脱液中的蛋白质的洗脱次

序。降低分离效果

4.洗涤平衡时，液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混

入

5.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象

（3）样品的加入和洗脱

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐

②滴加1ml透析样品：加样时，要贴壁加样，即使吸管口沿

管壁环绕移动，注意不要碰破凝胶面

③样品深入凝胶床：样品完全渗入凝胶层并关闭下出口

④洗脱：小心加入ph=7、20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，

连接洗脱瓶，打开下出口

⑤收集：待血红蛋白接近色谱柱底端时，用试管连续收集流

出液5ml一管

4.纯度鉴定

方法：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

课

后

反

思

及

使

用

建

议