课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学目标

选修1专题2 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

◇◇考点要求

1．研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。

2．能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。

◇◇双基过关

一、理论基础

1．筛选菌株

(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 或 其他微生物生长。 (2)选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

2．统计菌落数目

常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有 直接计数。

3．设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的 。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养 的培养基作为空白对照。

二、实验设计

关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：

1． 取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 中。

2．制备 ：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基

将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 ，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

3．微生物的 与观察

将10g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液 ，773转移至盛有 无菌水的大试管中，依次等比稀释至10稀释度，并按照由10～10稀释度的顺序分别吸取 进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。

将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 培养基的斜面中，观察能否产生如教材中图2-lO的颜色反应。

4．细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

参考答案：

一、1（1）目的菌珠 抑制

阻止

（2）特定 抑制

阻止 2.稀释度 细菌 30-300 显微镜

3.非测试因素 可信度 无杂菌污染

二、1. 土壤 纸袋（信封） 2. 培养基

多于 对照 3.培养 1ml 9ml 0.1mL 酚酞指示剂 4.30-300 平均数

◇◇典例分析

类型一

选择培养基的配制

【例1】分析下面培养基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：

1

选修1专题2 (1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 和 。

(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有，又是如何进行选择的? 解析：碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

答案：(1)葡萄糖 尿素 (2)有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

启示：选择培养基筛选微生物的原理：人为提供有利于目的茵株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

类型二

统计菌落数目

6【例2】用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为10的培养基中．得到以下几种统计结果，正确的是…( ) A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233 解析：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板．作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以 A、B不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

答案：D 启示：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组；在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需重新实验。

类型三

设置对照

【例3】用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是……………… ( ) A．未接种的选择培养基 B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基

c．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基 D．接种了的选择培养基

解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的原则是单一变量，所以与选择培养基一样接种、培养。

答案：C 启示：对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

◇◇基础自测

一、选择题

1．PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能忍受93℃左右的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找………………………………………( ) A．土壤中 B．海水中 C．热泉中 D．冷库中

2．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是………………………………………( ) A．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂、水

B．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、琼脂、水

C．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、尿素、琼脂、水

D．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水；

2

选修1专题2 3.某同学在稀释倍数为10的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)…………………………( ) 89 A．2.34×10 B．2.34×10 C．234 D．23.4 64.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应10培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有…………………( ) ①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照

A．①②③ B．②③④ C．①③④ D．①②④

5.关于土壤取样的叙述错误的是………( ) A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤 B．先铲去表层土3cm左右，再取样

C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌 D．应在火焰旁称取土壤

6.下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤中，正确的是…………( ) ①土壤取样 ②称取10g土壤取出加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1mL进行平板涂布

1234567④依次稀释至10、10、10、10、10、10、10稀释度

A．①→②→③→④ B．①→③→②→④ C．①→②→④→③ D．①→④→②→③

7.下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是………………………………………( ) 37 A．一般选用10～10倍的稀液分别涂布

3 45 B．测定放线菌的数量，一般选用10、lO和10倍稀释

345 C．测定真菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释

17 D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将10～10倍的稀释液分别涂布到平板上培养

8.下列关于微生物的培养叙述错误的是( ) A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2 d B．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d C．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4 d D．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间

9.下列操作需要在火焰旁进行的一组是( ) ①土壤取样

②称取土壤 ③稀释土壤溶液 ④涂布平板

⑤微生物的培养

A．①②③④⑤ B．②③④⑤④⑤ C．③④⑤ D．②③④

10.下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是 ……………………………………( ) A．以尿素为唯一氮源的培养基中加人酚红指示剂

B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂

D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

11.土壤取样时最好选择哪种环境中的土壤做分离细菌的实验…………………………( ) A．街道旁 B．花盆中 C．农田中 D．菜园里

二、非选择题

12.统计菌落数目一般用稀释涂布平板法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个 ，来源于样品稀释液中的一个 。计数时一般选择菌落数在 的平板计数。

613.在做本课题实验时，一位同学在稀释倍数为10的培养基中涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这3个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这一结果是否接近真实值?如果需要改进，如何改进?

14.在进行操作本课题实验时应特别注意： 、 、 。

15．在做本课题实验时，甲同学筛选出的菌落与其他同学不同，并且他在设计实验时并没有设置对照。思考下列问题：

6

3

选修1专题2 (1)你认为出现甲同学这种结果的原因可能是什么? (2)要帮助甲同学排除可能影响实验结果的因素，需要设置 ，实验方案有两种：一种方案是可以由其他同学用与甲同学 进行实验，如果结果与甲同学一致，则证明甲同学 ，如果结果不同，则证明甲同学存在操作 或 的配制有问题。另一种方案是将甲同学配制的培养基在不加 的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到 。

(3)由此问题你得出的启示是什么?

516．在10稀释度下求出3个平板上菌落数的平均值是63，那么每克样品中的菌落数是多少?

◇◇知识拓展

1．土壤中采集菌样

由于在土壤中几乎可找到任何微生物，所以土壤是首选的采集目标。土壤采样必须考虑以下几个问题：

(1)土壤中有机物的含量 有机物含量高，土质就肥，一般在其中微生物数量也越多，反之亦然。

(2)采土的深度 土壤的深度不同，其通气、养分和水分的分布情况也不同。表层的土壤由于直接受日光暴晒，故较干燥，微生物也不易大量繁殖。在离地面5～20 cm处的土壤，微生物含量最高。

(3)植被情况植被的种类与微生物的分布有着密切的关系。例如，在冬天灌水的水稻田土壤中，真菌的分布较多。

(4)采土的季节：以春秋两季为宜。这时土壤中的养分、水分和温度都较适宜，微生物的数量多。

(5)采土方法选择好适当地点后，用小铲子除去表土，取5～20 cm处的土样几十克，盛人事先灭过菌的防水纸袋内，并在上面记录采土时间、地点和植被等情况。

2．选择性培养基

选择性培养基是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。从混合样品中获得某种微生物的方法，通常有两种：第一种办法可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物，从而使它成为一种加富培养基。采用这类“投其所好”的策略即可使该微生物大大增殖，在数量上超过原有占优势的微生物，以达到富集培养的目的。用于加富的一些物质主要是一些特殊的碳源和氮源，如纤维素可被用来富集纤维素分解维生物，甘露醇用来富集自生固氮菌。第二种办法则可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物质，经培养后，由于原来占优势的他种微生物的生长受到抑制，而分离对象却可趁机大大增殖，使之在数量上占据优势。用于抑制他种微生物的选择性抑制剂有染料、抗生素等。

3.瘤胃与微生物

以牛与瘤胃微生物为例来加以说明。在瘤胃中约有一百种细菌和原生动物，只有细菌才是纤维素的真正消化者。另外瘤胃微生物还能利用尿素来合成菌体蛋白，有人在饲料中添加尿液或少量尿素，结果促进了牛、羊多长膘和产奶。据报道，牛所需的40％～90％的蛋白质，都来自瘤胃中的细菌。反刍动物与瘤胃微生物间是共生关系。

基础自测

参考答案：

一、1．C 2．A 3．B 4．A 5．C 6．C 7．B 8．D 9．D 10．A 11．D 二、12．菌落 活菌 30～300 13．不接近真实值，需要重新实验。

14．无菌操作 作好标记 规划时间

15．(1)可能的原因有两种：一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。 (2) 对照实验 一样的土样

，

无误，

失误

培养基 土样 污染。

(3)启示：做实验时一定要设置对照。 16．6.3×10。

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