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高考二轮专题：微生物的培养与应用

[考纲要求]

1.微生物的分离和培养B 2.某种微生物数量的测定B 3.微生物的应用B [夯实基础]

一、微生物的实验室培养

1．培养基

(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

(2)营养构成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。

(3)种类：按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。

2．无菌技术[连一连]

3．大肠杆菌的纯化培养

(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

配制步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。

(2)纯化大肠杆菌

①纯化大肠杆菌，其关键的步骤是接种。

②纯化培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。

③纯化培养原理：在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。

二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

1．分离原理

土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。以尿素为唯一氮源的培养基能促进分解尿素的细菌的生长和繁殖，并抑制或阻止其他微生物的生长，从而将目的菌分离。

2．统计菌落数目

统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

3．实验流程

土壤取样→制备培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。

三、分解纤维素的微生物的分离

1．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

(2)作用

1

2．菌种筛选

(1)方法：刚果红染色法。

(2)原理

纤维素分解菌

↓

刚果红纤维素酶→红色复合物――→红色消失、出现透明圈。纤维素即：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

3．筛选流程

土壤取样：富含纤维素的环境

↓

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量

↓

梯度稀释

↓

涂布平板：将样品涂布于含CR的鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈

知识速背

1．培养基

(1)培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营

养基质。

(2)培养基的营养成分：培养基可为微生物提供碳源、氮源、无机盐和水等主要营养物

质。

2．无菌技术

(1)措施：无菌技术的主要措施包括消毒和灭菌。

(2)常用方法：培养基灭菌常采用高压蒸汽灭菌法，接种环灭菌常采用灼烧灭菌法。

3．微生物的纯化与计数

(1)纯化微生物的方法：常用平板划线法和稀释涂布平板法。

(2)微生物的计数方法：常用显微计数法和稀释涂布平板法。

4．微生物的筛选

(1)尿素分解菌的筛选：以尿素为唯一氮源的选择培养基可以筛选分解尿素的细菌。

(2)尿素分解菌的鉴别：在以尿素为唯一氮源的选择培养基中添加酚红，指示剂可以鉴

别分解尿素的细菌。

(3)纤维素分解菌的筛选：利用富含纤维素的选择培养基可以选择培养分解纤维素的微

生物。

(4)纤维素分解菌的鉴别：在富含纤维素的培养基中添加刚果红，可以从周围存在不变

红的透明圈的菌落中挑选分解纤维素的微生物。

2

[要点讲解] 考点一

培养基及微生物的纯化培养技术

1．培养基的种类

(1)按物理状态分类

培养基种类

液体培养基

固体培养基

(2)按功能分类

种类

选择

培养基

制备方法

培养基中加入某些化学物质

培养基中加入某种指示剂或化学药品

条件

较为温和的物理或化学方法

强烈的理化因素

结果

原理

依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计

产生特定的颜色或其他变化

用途

从众多微生物中分离所需的微生物

鉴别不同种类的微生物

举例

加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌

用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌

特点

不加凝固剂

加凝固剂(如琼脂) 用途

工业生产

微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏

鉴别

培养基

2．消毒和灭菌的比较

项目

常用方法

应用范围

日常用品

不耐高温的液体

用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源

接种工具

玻璃器皿、金属工具

培养基及容器的灭菌

煮沸消毒法

仅杀死物体表面或巴氏消毒法

内部的部分对人体有害的微生物

化学药剂消毒法

杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

灼烧灭菌法

干热灭菌法

高压蒸汽

灭菌法

消毒

灭菌

3.纯化微生物的接种方法

项目

平板划线法

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基上。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

不能计数

适用于好氧菌

稀释涂布平板法

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落

可以计数，可以观察菌落特征

吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延

适用于厌氧菌和兼性厌氧菌

原理

优点

缺点

适用

范围

4．平板划线操作的注意事项

(1)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：

3

第一次操作

杀死接种环上原有的微生物

每次划线之前

划线结束

目的

杀死上次划线后接种环上残杀死接种环上残存的留的菌种，使下次划线的菌种菌种，避免细菌污染直接来源于上次划线的末端，环境和感染操作者

使每次划线菌种数目减少

(2)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。

(3)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

(4)划线时最后一区不要与第一区相连。

(5)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。

[典型例题]

1．下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是(

) 原料

蛋白胨/g 乳糖/g 蔗糖/g KH2PO4/g 伊红/g 美蓝/g 琼脂/g NaCl/g 蒸馏水/mL ①

10 5 5 2 0.4 0.065 10

1 000 ②

10 5 5 2

20

1 000 ③

10 5 5 2

20 1 000 ④

10 5 5 2

1 000 A．①③

B．②①

C．②④

D．③①

解析：选D。在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。

2．不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述，不正确的是(

) A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素

B．碳源物质也是该微生物的能源物质

C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质

D．水是该微生物的营养要素之一

解析：选B。碳源分为有机碳源和无机碳源。当有机物作为碳源时，既是碳源，又可作为能源；当无机物作为碳源时，只能作为碳源，不能作为能源。该碳源是二氧化碳，属于无机物，不能作为微生物的能源物质。

3．下列有关微生物实验的叙述，不正确的是(

) A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染

B．平板划线法可用于微生物的计数

C．分离不同的微生物要采用不同的稀释度

D．观察菌落的特征可以用来进行菌种的鉴定

解析：选B。微生物培养过程中要进行无菌操作，防止外来杂菌的入侵，以获得纯净的培养物，A正确；平板划线法可用于微生物的分离，B错误；土壤中各类微生物的种群数量是不4

同的，稀释的目的是为了使每个微生物个体充分分离，以便在平板培养时能得到由单个微生物个体生长而来的菌落，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度，C正确；每一种微生物在一定条件下形成固定的菌落特征，因此观察菌落的特征可以用来进行菌种的鉴定，D正确。

(3)接种环

①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始

(4)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质

不合理，缺少空白对照

考点二

微生物的分离与计数法

1．筛选菌株

(1)原则：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

(2)菌株筛选原理的比较

选择培养基的成分

土壤中分解尿

素的细菌

尿素作为唯一的氮源

在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素

分解纤维素的微生物

纤维素作为唯一的碳源

刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈

鉴定方法

2．几种典型微生物的筛选方法

(1)培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

(2)培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

(3)培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物。

(4)当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如当石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

(5)改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养，只能得到耐高温的微生物。

3．统计菌落数目的方法

(1)显微镜直接计数法

①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。

③缺点：不能区分死菌与活菌。

(2)间接计数法(活菌计数法) ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

[典型例题]

1．科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株Q，步骤如下图所示，下列相关的叙述中，错误的是(

) 5

A．步骤①～③中，培养液中需加入多环芳烃菲作为唯一碳源

B．步骤①～③中，将锥形瓶放在摇床上充分振荡，使菌株与培养液充分接触

C．步骤④是利用平板划线法纯化菌株Q，图中所示接种环最少灼烧2次

D．步骤④中每一区域可重复画几次，但1区和5区不能出现交叉

解析：选C。要想分离出能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株Q，所用培养液中需加入多环芳烃菲作为唯一碳源，A正确；培养过程中，将锥形瓶充分振荡，目的是使菌株与培养液充分接触，B正确；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成步骤④共需灼烧接种环6次，C错误；纯化菌株Q过程中，由于线条末端细菌的数目比线条起始处要少，所以在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，1区和5区不能交叉，D正确。

2．尿素是一种重要的农业肥料，但是不经过细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)，培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示，请回答下列问题：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10 g 1 g 15 g 将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL

(1)此培养基能否用于植物组织培养？________，理由是

________________________________________________________________________。

(2)培养基中氮源是________，这种培养基在功能上属于________培养基，目的是只允许能合成________的微生物生长，其他微生物均不能生长。

(3)欲从土壤中分离获取上述特定微生物，可采用__________________________________法进行接种。

(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________________________________________________________________________，

使指示剂变红色，而筛选纤维素分解菌的方法是 __________________法。

解析：(1)由于植物组织培养过程必须添加植物激素，故该培养基不能用作植物组织培养。

(2)分析表格中信息，培养基成分中含有氮元素的物质是尿素；由于尿素为唯一氮源，可以筛选分解尿素的细菌，这种培养基属于选择培养基；由于脲酶能促进尿素的水解，因此分解尿素的细菌能够合成脲酶。

6

(3)分离微生物常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。

(4)由于尿素分解后产生氨，可使培养基显碱性，从而使酚红指示剂变红；由于纤维素能被刚果红染成红色，因此培养基中加入刚果红可以鉴定分解纤维素的细菌。

答案：(1)不能

缺少植物激素

(2)尿素

选择

脲酶

(3)稀释涂布平板法或平板划线

(4)酚红指示剂

刚果红染色

3．下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关内容的叙述中，不正确的是(

)

A．实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基

B．图中Ⅰ、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释

C．统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数

D．在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型

解析：选B。从混合物中分离某种微生物要用选择培养基，利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使其成为一种“加富”培养基，可使该微生物大量繁殖，在数量上超过原来占优势的微生物，以达到富集培养的目的，用于“加富”的一些物质主要是一些特殊的碳源和氮源，A正确；图中Ⅰ、Ⅱ过程目的是增加目标微生物的数量，B错误；由于一个菌落可能不是由1个细菌，而是由2个或更多个细菌形成，故统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数，C正确；在⑤处培养基上形成菌落的微生物是以对羟基苯甲酸作为碳源，故其同化作用类型为异养型，D正确。

4．饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程示意图。请分析回答下列问题：

(1)培养基中除了添加植酸钙以外，还应含有________、________、水、无机盐等基本营养物质。

(2)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行________________，而且须将接种后的培养皿呈________状态放置。

(3)接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成________________。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的________就能大致推测出样品中的活菌数。

(4)由于植酸钙的不溶解性，使培养基中形成白色浑浊。产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌7

落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶。实验结果显示A～E五种菌株中，________是产植酸酶的理想菌株。

(5)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行____________________________。

解析：(1)微生物生长所需的营养物质一般都含有水、无机盐、碳源、氮源等。(2)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿进行灭菌处理，而且须将接种后的培养皿呈倒置状态放置，以防止污染。(3)接种以前对样品进行稀释的目的是在培养皿表面形成单个菌落，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大致推测出样品中的活菌数。(4)根据题意，透明圈越大，说明植酸酶越多，故E是最理想菌株。(5)获得目的菌后，若用于植酸酶的生产，还需要进行扩大培养。

答案：(1)碳源

氮源 (2)(高压蒸汽)灭菌

倒置(3)单个菌落

菌落数(4)E(5)扩大培养

[习题强化]

1．(2015·高考江苏卷)人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：

(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________(填序号)。

①酒精灯

②培养皿

③显微镜

④无菌水

(2)在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________ ____________________。

(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落(见图)。图中降解圈大小与纤维素酶的________有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是________(填图中序号)。

(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，

测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

8

答案：(1)③

(2)培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果

(3)避免培养基污染棉塞

(4)量与活性

①

(5)J4 发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高

2．牛奶是微生物生长的良好培养基。生鲜牛奶中的微生物情况反映了奶牛的健康状况，也影响奶制品的运输和贮藏。牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：

(1)微生物培养操作过程中，为了防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________(消毒、灭菌)，操作者双手要进行清洗和________。除巴氏消毒外，还有____________和化学试剂消毒法。

(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，选择的涂布工具称为________，为防止杂菌污染，该工具应浸泡于酒精中，涂布前应________________________________________________________________________。

(3)图中所示方法为稀释培养法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为________个。运用这种方法统计的结果往往较实际值________(填“偏大”或“偏小”)，原因是________________________________________________________________________。

9

答案：(1)灭菌

消毒

煮沸消毒法

(2)涂布器

将涂布器引燃(灼烧)后待冷却

6(3)3.4×10

偏小

当两个或多个菌落重叠在一起时按一个菌落计算

3．如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：

(1)图甲是利用________________法进行微生物接种，图乙是利用________________法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________________和酒精消毒。

(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？________________________________________________________________________ ________________________。

(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？________________________________________________________________________。

(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填图甲或图乙)。

答案：(1)平板划线

稀释涂布平板

接种环

涂布器

灼烧灭菌

(2)火焰附近存在着无菌区域

(3)避免培养过程产生的水分影响微生物的生长

(4)图乙

4．耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图所示。

(1)进行①过程的目的是________；②过程所使用的接种方法是________________法。

(2)从用途上来说，Ⅰ号培养基属于________培养基，仅以淀粉作为________源；从物理状态上来说，Ⅱ号培养基属于固体培养基，配制时应加入________作为凝固剂。

(3)Ⅰ、Ⅱ号培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是________________；一般对配制的培养基采用________________法灭菌。

(4)部分嗜热菌在

Ⅰ

号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈；应挑出透明圈______(大或小)的菌落，接种到

Ⅱ 号培养基。

答案：(1)稀释

稀释涂布平板

(2)选择

(唯一)碳

琼脂

(3)先调节pH，后灭菌

高压蒸汽灭菌

(4)淀粉酶

大

10