课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质教案设计

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1．明确用培养基对微生物进行选择的原理。(重点) 2．学会统计微生物数量的方法。(重点) 3．能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。(难点)

菌

株

的

筛

选

及

统

计

菌

落

数

目

的

方

法

1．筛选菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a．选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

2．统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。

1



生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的①原理

一个活菌b.通过统计平板上的菌落数来推测样品中

大约含有的活菌数②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

③注意事项

a.当样品的稀释度足够高时，培养基表面

a．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。

b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)其他方法：利用显微镜直接计数。

[合作探讨]

探讨1：根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？

提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。

探讨2：如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。

探讨3：稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。

提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。

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[思维升华]

1．选择培养基的选择作用

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

2．显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。如下图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

3．用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在3

一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

4．直接计数法与间接计数法的比较

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：

主要用具

计数依据

优点

缺点

计算

公式

直接计数法

显微镜、细菌计数板

菌株本身

计数方便、操作简单

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌株数＝400×1 0000×每小格平均菌株数×稀释倍数

间接计数法

培养基

培养基上菌落数

计数的是活菌

操作较复杂，且有一定误差

每毫升原液含菌株数＝平均菌落数×稀释倍数

所用涂布液的体积mL

实

验

设

计

及

操

作

提

示

1．实验设计

(1) 养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多—②土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿③取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层(2)

准备选择培养基，以尿素为唯一—

氮源制备9个平板培养基(3) ①取样原因：土壤有“微生物的天然培

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平板上生长的菌落数目②稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间，便于计数—③稀释倍数：测定土壤中细菌的数量，一般101010选用、和倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释；测定真菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释456345234①稀释原因：样品的稀释程度直接影响

(4) 分别用记号笔写上10、10、10倍的三种稀释液，然后用三支1 mL无菌吸管分别从10、—10、10倍的三管土壤稀释液中吸取0.1 mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀456456在上述培养基的9个平板底面，每三个一组(5) 不同的培养温度和培养时间—②观察：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果(6) ①培养：不同种类的微生物，往往需要

当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个—平板进行计数，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目2．操作提示

(1)无菌操作

①取土样的用具在使用前都需要灭菌。

②应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

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③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。

3．菌种鉴定

(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

[合作探讨]

探讨1：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？

提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的；为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。

探讨2：在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？

提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。

探讨3：统计菌落数目的理论依据是什么？

提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

探讨4：为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。

[思维升华]

1．分离尿素分解菌操作中的注意事项

(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，细菌一般6

为104、105、106倍的稀释液，放线菌一般为103、104、105倍的稀释液，真菌一般为102、103、104倍的稀释液。

(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。

(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。

(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。

(7)做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。

(8)规划时间

对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。

2．结果分析与评价

内容

结果分析

对照的培养皿中无菌落生长―→未被杂菌污染

有无杂菌污染的判断

培养基中菌落数偏高―→被杂菌污染

菌落形态多样，菌落数偏高―→培养物中混入其他杂菌

选择培养基的筛选作用

牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目―→选择培养基具有筛选作用

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板―→操作成功

若选取同一种土样，统计结果应接近

样品的稀释操作

重复组的结果

课堂小结：

网络构建

核心回扣

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1.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

2.设置对照的主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

3.不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

4.在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。

5.为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。

6.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。

7.鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，根据是否变红进行判断。

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