课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计第一课时

课题二

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、教学目标

（一）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（三）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

二、学情分析

在天津步入2017新课改之后，天津高中学生第一次面临选修一的学习，这部分内容对学生来说很新颖，学生对于微生物的学习领域也基本上是空白，学生学习积极性很高，在教学过程中，要引导学生注重于实际生活的联系，又要通过实验帮助学生加强对本节内容的理解。

三、重点难点

1、对土样的选取和培养基的配制

2、对尿素分解菌的计数

四、教学过程

导入：尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

一、筛选菌株

1、PCR技术

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。

启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2、实验室中微生物的筛选原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；

方法：

⑴抑制大多数微生物的生长

⑵促进目的菌株的生长

结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。

3、培养基选择分解尿素的微生物的原理

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

二、统计菌落数目

1、显微镜直接计数：

利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；

个体小的细菌在显微镜下难以观察；

2、间接计数法（活菌计数法）

⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖

而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

注意事项

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。（多个细胞连在一起，只看到一个菌落）

三、设置对照

主要目的是排除实验组中非测试因素对实验

结果的影响，提高实验结果的可信度。

判断培养基中是否有杂菌污染：

将未接种的培养基同时进行培养。

判断选择培养基是否具有筛选作用：

完全培养基（营养成分齐全）接种后培养

观察菌落数目。

四、实验设计

于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管

。

释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

分离不同的微生物采用不同的稀释度

目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板

原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。

结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

五、微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d

放线菌：25～28℃培养5～7d

霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

操作提示：

[一]无菌操作

1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

[二]做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品

的稀释度等。

[三]规划时间

六、结果分析与评价

1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确

七、课外延伸

1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素，产生氨，碱性增强。

2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器（滤膜法）过滤后，将滤膜放到

伊红-美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。