课题3　血红蛋白的提取和分离ppt配套的教学设计方案

课题3 血红蛋白的提取和分离

【课题目标】

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

【课题重点】：凝胶色谱法的原理和方法

【课题难点】：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

【教学工具】：多媒体课件

【教学过程】：

（一）引入新课

蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的相继完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。

（二）进行新课

1．基础知识

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。

凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

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（2）概念：根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。

（3）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（4）分离过程：（图5－13b）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1．2缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

1．3凝胶电泳法：

（三）

电泳：

1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

2.原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。

影响蛋白质分子运动速度的因素

聚丙烯酰胺凝胶电泳：

1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。

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2.原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。

3. SDS作用机理: SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量

讨论：如何测定蛋白质的分子量？

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。

二、实验操作

（一）蛋白质提取和分离步骤

样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

血液有哪些成分？

用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。

血红蛋白的特点：每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。

（二）操作过程

1.样品处理和粗分离：

（1）洗

涤

红

细

胞

阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？

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(1)红细胞的洗涤: ①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。

②洗涤操作：

1、采集血样。

2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）

3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。

4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤(生理盐水)。

5、低速离心（低速短时间）

6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。

洗涤方法：

采用低速短时间离心，如500r／min,离心2min然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

思考：能否用蒸馏水代替生理盐水？

不能；生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起加大分离难度。

（2）释放血红蛋白

阅读思考：

1、释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？

2、为了加速释放过程，采取了什么措施？

目的分析：

蒸馏水的作用是使红细胞大量吸水胀裂

加入甲苯的作用是溶解红细胞的细胞膜

充分搅拌的目的是加速红细胞的破裂

为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？

（3）分离血红蛋白

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。

②试管中溶液层次：

第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；

第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；

第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)；

第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。

③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

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2、以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( D

) A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂

B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少

C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测

D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢

3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于( B) A.电荷的多少

B.分子的大小

C.肽链的多少

D.分子形状的差异

4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是(D) A.调节pH

B.维持红细胞的能量供应

C.防止微生物生长

D.防止血液凝固

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