课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教案设计

汉中市龙岗学校高中生物选修1-学案12

2017年

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专题五—DNA和蛋白质技术---------﹠5．3血红蛋白的提取和分离

学习目标：

1．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。

2．体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。

3．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理。

【预习案-夯实基础】自主认真阅读课本补充完成相关内容：

蛋白质的各种特性的差异如分子的______和______、所带________________、溶解度、________和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

一、凝胶色谱法

1．概念：凝胶色谱法也称做__________，是根据_________________的大小分离蛋白质的有效方法。

2．原理：大多数凝胶是由________化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量____的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程______，移动速度______；而相对分子质量______的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在________移动，路程______，移动速度______。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

3．凝胶材料：______性，______类化合物，如葡聚糖或________。

4．具体过程：

（1）________混合物上柱。（2）洗脱开始，______________的蛋白质______进入凝胶颗粒内；相

对分子质量______的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。（3）________________的蛋白质被滞留；__________________的蛋白质向下移动。（4）相对分子质量不同的分子完全分开。（5）____________的蛋白质行程较短，已从________中洗脱出来，________________的蛋白质还在行进中。

提示：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

二、缓冲溶液

1．作用：在________内，能够抵制外界的________对溶液____的影响，维持____基本不变。

2．配制：通常由________溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的______就可以制得在不同________使用的缓冲液。

三、电泳

1．概念：带电粒子在______的作用下发生______的过程。

2．原理：许多重要的生物大分子，如______、______等都具有________的基团，在一定pH下，这些基团会带上______或______。在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷__________移动。电泳利用了分离样品中各种分子__________以及分子本身的______、______不同，使带电分子产生不同的________，从而实现样品中各种分子的分离。

3．分类：________凝胶电泳、__________凝胶电泳。

在测定蛋白质相对分子质量时通常使用__________________凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带________的多少以及__________等因素。而在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能使蛋白质发生________，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会______成单条肽链，因此测定的结果只是________的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于__________。

四、蛋白质的提取和分离

蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、粗分离、______和________。

1．样品处理及粗分离

血液由__________和__________组成，其中红细胞最多。红细胞的组成中，除水分以外，约90%是__________。血红蛋白由______条肽链组成，包括两条__________和两条__________。其中每条肽链环绕一个__________基团，此基团可携带一分子氧或一分子__________。血红蛋白因含有________而呈现____色。

（1）红细胞的洗涤

①目的：去除________。

②方法：采用________离心，如500 r·min－1离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色______，将下层______的红细胞液体倒入______，再加入五倍体积的________，缓慢搅拌________，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有______，表明红细胞已洗涤干净。

（2）血红蛋白的释放

将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加________到________体积，再加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在________和________的作用下，红细胞______，释放出血红蛋白。

（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层（从上往下）：

第1层：________的甲苯层。

第2层：脂溶性物质的沉淀层——______薄层固体。

第3层：________的水溶液——红色透明液体。

第4层：其他杂质的________沉淀物。

将液体用______过滤，除去______________，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的________液体。

（4）透析：取1 mL的________溶液装入________中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol·L－1的__________中（pH为______），透析12 h。

透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的，能使______自由进出，而将______保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子量较____的杂质，或用于更换样品的______。

2．纯化——凝胶色谱操作

处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等），因此要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。

第一步要制作__________。第二步要__________________，因为____的凝胶和用________平衡好的凝胶的体积差别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不能有______存在。第三步是样品的______和______。

3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断________的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

五、注意事项

1．红细胞的洗涤

洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去________；离心速度过高和时间过长会使________等一同沉淀，达不到分离的效果，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2．色谱柱填料的处理

商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在________中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入__________的湿凝胶用________加热，逐渐升温至接近沸腾。这种方法不仅时间______，还能除去凝胶中可能带有的________，排除胶粒内的______。

3．凝胶色谱柱的装填

装填凝胶时要尽量________，从而降低颗粒之间的空隙。不能有________存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的________，降低分离效果。洗脱液不能______，露出凝胶颗粒，否则需重新装填。

4．蛋白质的分离

分离过程中，仔细观察________在洗脱过程中的移动情况。如果色谱柱装填成功、分离操作正确，能清楚地看到红色区带狭窄、平整、均匀一致地随着洗脱液缓慢移动；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，与凝胶色谱柱的装填有关。

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汉中市龙岗学校高中生物选修1-学案12

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【探究案-思考探究】

回答下列有关提取生物体内物质的问题：

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成部分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。我们应选用________的血液进行实验。取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入________。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是________；乙装置中，C溶液的作用是________。

(3)甲装置用于________，目的是________________。用乙装置分离蛋白质的方法叫________，是根据________________分离蛋白质的有效方法。

(4)最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行________。

(5)图丙为用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。根据结果，某同学得出：“提取的血红蛋白有两条肽链”的结论，这种说法可靠吗？并说明理由_________________________________ ____________________________________________________________________________________。

【训练案-巩固提升】

(

)1．凝胶色谱法所用的凝胶的化学本质大多是

A．糖类化合物

B．脂质 C．蛋白质 D．核酸

(

)2．分离血红蛋白溶液时，离心后试管的溶液分四层，血红蛋白在第________层

A．一 B．二 C．三 D．四

(

)3．________的蛋白质能进入凝胶内部通道

A．相对分子质量大的 B．吸附性高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的

(

)4．下列试剂可用于血红蛋白释放的是

①0.9%的生理盐水 ②甲苯

③磷酸缓冲液 ④蒸馏水

⑤柠檬酸钠

A．②④ B．①④ C．④⑤ D．①③

(

)5．洗涤红细胞时，离心所采用的方法是

A．低速长时间离心 B．低速短时间离心 C．高速长时间离心 D．高速短时间离心

(

)6．下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是

A．层析柱高 B．层析柱的直径 C．缓冲溶液 D．样品的分布

(

)7．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是

A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐

B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果

C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水

D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质

(

)8．蛋白质的提取和分离分为哪几步

A．样品处理，凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

(

)9．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是

A．增大蛋白质的相对分子质量 B．改变蛋白质的形状

C．掩盖不同种蛋白质间的电荷差别 D．减少蛋白质的相对分子质量

(

)10．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是

A．防止血红蛋白被氧化 B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和

C．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程

D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

(

)11．使用凝胶色谱法分离蛋白质时，洗涤红细胞、释放血红蛋白和透析过程中，分别使用下列哪些试剂①蒸馏水 ②生理盐水 ③20 mmol/L的磷酸缓冲液

④清水 ⑤柠檬酸钠

A．①③⑤ B．①②③ C．②①③ D．④①③

(

)12．关于血红蛋白分子组成的叙述正确的是

A．两条α－肽链、两条β－肽链、一个亚铁血红素基团

B．一条α－肽链、三条β－肽链、四个亚铁血红素基团

C．两条α－肽链、两条β－肽链、四个亚铁血红素基团

D．两条α－肽链、两条β－肽链、两个亚铁血红素基团

(

)13．下面说法不正确的是

A．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

(

)14．下列关于凝胶色谱法的正确认识是

A．凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些多孔球体是由脂类化合物构成的

B．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的移动速度快，先分离出来

C．在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙

D．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢，后分离出来

(

)15．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是

A．将样品装入透析袋中透析12小时，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内

B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快

C．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中

D．若用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和戊形成的电泳带相距最远

16、PCR技术可扩增DNA分子，电泳技术是将待测样品放在光滑的凝胶薄膜上，并加上直流电场，可利用分子带电荷不同分离和分析氨基酸和多核苷酸片段等有机物。这两项技术综合应用于现代刑侦，可以获得最可靠的证据。下图是一次寻找嫌犯的测试结果：图甲是把遗迹中含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果；图乙是通过提取罪犯B遗迹DNA和四位嫌犯的DNA进行扩增，并采用特定限制酶处理后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱。

(1)在同一电场下，由于蛋白质或DNA的________以及________、________不同而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品的分离。

(2)由图甲得知，多肽由__________种氨基酸组成；由图乙可知B最可能的对象是______________。

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