课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质课教案整理

题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、研究思路

（一）筛选菌株

1.实例：PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。

提出的问题—如何寻找耐高温的DNA聚合酶？

解决问题的思路—寻找耐高温环境。

原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物

获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2.实验室微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

3.选择培养基

本课题使用的培养基

KH2PO4

1.4g

NaHPO4

2.1g

MgSO4 .7H2O

0.2g

葡萄糖

10.0g

尿素

1.0g

琼脂

15.0g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。

问题1：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？

（1）概念：

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

（2）例子：

加入青霉素的培养基—细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。

不加含碳有机物的无碳培养基

—分离自养型微生物。

例1(

)用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是

A.未接种的选择培养基

B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C.接种了的选择培养基

D.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

变式训练

苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：

(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用_____________法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于___________________________________________

；

使用______________________________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是__________________________________________________。

(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？

________________________________________________________________________

（二）统计菌落数目

1.显微镜直接计数

(1)原理:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)具体做法：

每一个大方格边长为

1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3

以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，一个大方格中的总菌数是多少?

1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）

（3）优缺点：

优点：能准确统计微生物的实际数目。

缺点：不能区分死菌和活菌。

（1）常用方法：

（3）计数

例2（

）某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）

A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4 例3：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

二、实验设计

1.土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.制备培养基：牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。

选用稀释倍数为103~107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。

3.样品稀释、取样涂布：

4.微生物的培养、观察并记录结果：将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d；放线菌一般在25~28℃的温度下培养5~7d；而霉菌一般在25~28℃的温度下培养3~4d。

一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。

5.细菌的计数：

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

例4（

）在做分离“分解尿素的细菌”实验时，A同学从对应10﹣6培养基中筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落．下列有关叙述不正确的是

A. A同学出现这种结果的原因可能是土样不同

B. 可以将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染

C. 让其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果结果与A同学一样，则可证明A同学无误

D. B选项的实验思路都遵循了实验的对照原则，而C选项的

变式训练(

)下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是

A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板

B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布到不同平板上培养

C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数