课题3　血红蛋白的提取和分离第二课时教案

㈡ 缓冲溶液

1、概念：在 的范围内，能对抗外来 强酸、强碱或稍加稀释不引起 发生 的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、作用：能够抵制 的对溶液的 的影响，维持PH基本不变。

3、缓冲溶液的配制

通常由

种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得

使用的缓冲液。

思考1：说出人体血液中缓冲对？

思考2：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

使用的是 缓冲液，目的是利用缓冲液模拟 内的PH环境，保证 的正常结构和功能，便于观察（ 色）和材料的科学研究（活性）

㈢电泳

1、概念：指 发生迁移的过程。

2、原理：许多重要的生物大分子，如

等都具有 在

下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其

移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身

、

的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分带电性质、分子大小和形状的加入待分离的不同，使分子迁移速度不同

离。

样品

3、分类

① 电泳

阴阳极

极

② 电泳。

溶测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）

液

—聚丙稀酰胺凝胶电泳

槽

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带

分子向阳极移动

缓冲液

的多少以及分子的 等因素。

凝胶电泳原理示意图

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 。SDS能使蛋白质发生完全 。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于 。

二

实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定

1.样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除 ②方法： 离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，

2

琼脂胶

将下层

的红细胞液体倒入

再加入用 的 （质量分数为0.9％的氯化钠溶液）洗涤。

缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。

低速短时间离心，除去上层黄色血浆 加生理盐水再离心，除去黄色上清液 如此重复洗涤

次，获得纯净的红细胞。 (2)血红蛋白的释放

加 到 体积，再加40％体积的 溶解细胞膜，置于 上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 第1层（最上层）： 甲苯层

第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体

第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体

第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层

(4)透析 2.凝胶色谱操作

1）凝胶色谱柱的制作

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切下 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c.剪尼龙网小圆片覆盖在 上，用 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管一端。

d、色谱柱下端用移液头部做 ，连接一细的 ，并用螺旋夹控制尼龙管的 ，另一端放入收集 的收集器内

③顶塞的制作：

插入安装了玻璃管的橡皮塞

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

2）凝胶色谱柱填料的处理

（1）凝胶的选择： 。

（2）方法：

配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。

（3）凝胶色谱柱的装填方法

①

固定：将色谱柱处置固定在支架上

②装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

③洗涤平衡

3

装填完毕后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分 12小时。

3）样品加入与洗脱

①调整缓冲液面，与凝胶面平齐：打开下端出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：用 将1ml 的样品加到色谱柱的 ③样品渗入凝胶床： ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱

⑤收集：待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一试管，连续收集

思考1：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

血红蛋白是 蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

思考2：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括： 、 、 和 鉴定。首先通过 红细胞、 的释放、 等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。

3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度

电泳方法步骤

1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备

3）样品处理： 4）把凝胶固定于电泳装置上

5)加样：按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品

6)电泳

7）剥胶 8）染色 9)脱色 10)观察结果 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。

三

实验结果分析与评价

观察血液样品离心后是否 ，如果分层不明显，可能是洗涤次数 、未能除去 的原因。此外，离心速度 和时间，会使 细胞和 细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

讨论：如何测定蛋白质的分子量？

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。

4

课堂练习

1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质

(

)

A．路程较长，移动速度较慢

B．路程较长，移动速度较快

C．路程较短，移动速度较慢

D．路程较短，移动速度较快

2.蛋白质提取和分离分为哪几步

(

) A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳

B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

3.

在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是

(

)

A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程

B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和

C．防止血红蛋白被02氧化

D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

4．在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明

(

)

A．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动

B．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动

C．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动

D．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动

5.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（

）

A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

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