复习与测试名师教学设计2

选修1《生物技术实践》一轮复习知识梳理

专题1 传统发酵技术的应用

课题1 果酒和果醋和制作

【补充知识】发酵

1、概念：利用微生物或其他生物的细胞在有氧或无氧条件下繁殖或积累其代谢产物的过程。

2.

传统发酵技术(都是采用自然发酵的工艺),如：传统的葡萄酒酿造，就是葡萄破碎入罐以后，不人为地添加任何菌种，靠葡萄本身携带的自然界的酵母菌，在葡萄浆或分离后的葡萄汁里自发地繁殖，最终发酵成葡萄酒。

3、类型：

⑴根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵。

⑵根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等。

一、基础知识

（一）果酒制作的原理

⑴果酒发酵的菌种：酵母菌，属于真核生物

⑵酵母菌的代谢类型是：异养兼性厌氧型

有氧时，进行有氧呼吸，反应式为：C6H12O6+6H2O+6O2

→

6CO2+12H2O+能量；大量繁殖，

无氧时，能进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6

→酶

2C2H5OH+2CO2+能量。

⑶酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖

孢子生殖. ⑷酵母菌繁殖的最适温度20℃左右，酒精发酵一般控制在18～25℃。

⑸

传统发酵技术所使用的酵母菌的来源：主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌。

也可以在果汁中加入人工培养的酵母菌。

注意：

①在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色. ②酒精发酵过程中，要保持缺氧、酸性环境。在缺氧

呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

③.酒精发酵过程中，要

“先通气后密封”？“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖。“密封”的目的是使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。

（二）果醋制作的原理

⑴菌种是醋酸菌，属于原核生物

⑵醋酸菌的代谢类型为异养需氧型。

有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。

当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，反应简式为C2H5OH+O2

→

CH3COOH+H2O。

⑶醋酸菌的生殖方式：生殖方式为二分裂. ⑷醋酸菌最适生长温度为30～35℃。

⑸菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买，或从食醋中分离醋酸菌。

注意： ①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动。变酸的酒表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形成的。

②醋酸菌最适生长温度为30～35℃。，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。

二、实验设计

1、流程图

挑选葡萄



冲洗



榨汁



酒精发酵



醋酸发酵

酶

酶





果酒

果醋

充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。

排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染，其作用类似巴斯德的鹅颈瓶。

出料口是用来取样的。

2、制作实例

实验材料

葡萄、榨汁机、纱布、醋酸菌（或醋曲）、发酵瓶（如右图）、气泵、体积分数为70%的酒精等。

实验步骤

1．对发酵瓶、纱布、榨汁机等实验用具进行清洗并消毒。榨汁机要清洗干净，并晾干。发酵瓶要清洗干净，用体积分数为70%的酒精消毒

，晾干待用。

2．取葡萄500g(新鲜的葡萄)。

3．用清水冲洗葡萄1－2遍除去污物。（注意不要反复多次冲洗。）

(榨汁前应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。) 4．用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中。（如果没有合适的发酵装置，可用500mL的塑料瓶替代。但注入的果汁量不要超过塑料瓶总体积的2/3。要留出大约1/3的空间。）装入葡萄汁后，封闭充气口。

5．将发酵瓶置于适宜的温度（18－25℃）下发酵。

6．由于发酵旺盛期CO2的产量非常多，因此需要及时排气，以防止发酵瓶爆裂。（如果是简易发酵装置，每天拧松瓶盖2～4次。进行排气。）

7．10天后(10～12d左右)，取样检验。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。

果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。

检测时，先在试管中加入发酵液2mL，再滴入物质的量的浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴。振荡试管，观察颜色. 8．当果酒制成以后，可在发酵液中加入醋酸菌（或醋曲），然后移至30－35℃条件下发酵，时间控制在7～8d左右，适时用气泵向发酵液中充气。（如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口上盖上纱布。以减少空气中尘土等的污染。）

注意：

⑴应该从发酵制作的过程进行全面的考虑防止发酵液被污染？

如，榨汁机、发酵装置要清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。

⑵制葡萄酒时，温度控制在18～25 ℃发。温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20 ℃左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。制葡萄醋时，

要将温度控制在30～35 ℃。

醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35 ℃，因此要将温度控制在30～35 ℃。

⑶制葡萄醋时，

醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。

（二）练习

2.提示：大规模生产时需要进行更为全面周详的考虑，如原料的来源与选择、菌种的培育与选择、发酵的设备、发酵条件的自动化控制，以及如何严格控制杂菌污染；等等。此外，无论是葡萄酒或葡萄醋，实验时所检测的发酵液，并非商品意义上的产品。在实际生产中还需沉淀过滤、灭菌装瓶等获得成品酒或醋。葡萄酒还需在一定设施和条件下（如橡木桶和地窖）进行后续发酵，以获得特定的风味和色泽。

3.提示：需考虑厂房、设备投资、原材料采购、工人人数及工资、产品种类、生产周期、销售渠道、利润等问题。

课题2 腐乳的制作

一、基础知识

腐乳制作的原理

⑴腐乳的发酵有多种微生物(如青霉、酵母、曲霉、毛霉等)的协同作用，其中起主要作用的是毛霉，它是一种真核生物

⑵新陈代谢类型是异养需氧型。营腐生生活。

毛霉等微生物产生的蛋白酶可以将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可以将脂肪水解成甘油和脂肪酸。与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。

⑶生殖方式是孢子生殖。

⑷发酵的温度为

15～18 ℃

⑸菌种来源：传统腐乳的生产中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子。现代的腐乳生产是在严格的无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品的质量。

注意:优良菌种的选择：不产生毒素；生长繁殖快，且抗杂菌力强；生长的温度范围大，不受季节的限制；有蛋白酶、脂肪酶、肽酶等酶系；使产品气味正常良好。

二、实验设计

1、实验流程

让豆腐长出毛霉→加盐腌制→加乳汤装瓶→密封腌制。

2、制作实例

实验材料：含水量70%的豆腐，粽叶，盘子，盐，黄酒，米酒，糖，香辛料等，广口玻璃瓶，高压锅等。

实验步骤

1．

将豆腐切成3cm×3cm×1cm若干块。所用豆腐的含水量为70％左右。

用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形，且影响毛霉有氧呼吸。

用含水量过少不利于毛霉生长，毛霉生长离不开水。

样品水分含量（%）计算公式如下：

(烘干前容器和样品质量-烘干后容器和样品质量)/烘干前样品质量

2．将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内（粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用），每块豆腐等距离排放，周围留一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。

3．将平盘放在温度为15～18 ℃的地方，毛霉逐渐生长，大约5d后，

豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。

4．当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除保鲜膜及铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味，这一过程一般持续36h以上。

5．豆腐凉透后，将豆腐间的连在一起的菌丝拉断，并整齐排在容器内，准备腌制。

6．长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）分层摆放，分层加盐，并随层高而增加盐量，在接近瓶口表面盐要铺厚一些，以防止杂菌污染，约腌制8d。（豆腐与盐质量分数比为5︰1）

盐的作用

⑴抑制微生物的生长，避免腐败变质

⑵析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂

⑶.调味作用，给腐乳以必要的咸味

⑷.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。

盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。

注意：先发酵后加盐

7．将黄酒、米酒和糖、香辛料等混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12%左右为宜。（卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。）

乳汤中酒的含量应控制在12%左右。酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，而且不足以抑制微生物生长，豆腐易腐败，难以成块。酒精含量过高，对蛋白酶的抑制作用也越大，腐乳成熟的时间将会延长。

酒的作用：

⑴防止杂菌污染以防腐

⑵与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味

⑶.酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系

。

香辛料的作用：

⑴调味作用，不能增加营养。

⑵杀菌防腐作用

⑶参与并促进发酵过程

8．将广口玻璃瓶刷洗干净，用高压锅在1000C蒸汽灭菌30min，将腐乳成坯摆入瓶中，装瓶时要迅速小心；加入卤汤和辅料后，要用胶条将瓶口密封；封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。。在常温下，一

般六个月即可以成熟。

注意、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。

前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程，通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。

注意：

①用来腌制腐乳的玻璃瓶，刷干净后要用沸水消毒。

②吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。“皮”对人体无害。

课题3 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量

一、泡菜制作原理

1.菌种

⑴乳酸菌 常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。

⑵代谢类型:异养厌氧型，在

无氧条件

情况下，将葡萄糖分解成乳酸。

酶2C3H6O3+能量 反应式为：C6H12O6⑶

生殖方式分裂方式:二分裂 ⑷培养温度:

常温

⑸分布：分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道

⑹应用：常用于生产_酸奶。

注意：含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素能杀死乳酸菌。

2.腌制条件

时间 温度 食盐的用量 水和盐为4∶1 温度过高、食盐用量不足10％，腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。

3.亚硝酸盐

⑴物理性质：

白色

粉末、易溶于水。

⑵应用：在食品生产中常用作食品

添加剂

。

⑶分布：自然界中分布广泛。据统计，亚硝酸盐在蔬菜中的平均含量约为4mg/kg，咸菜中平均含量在7mg/k

以上，而豆粉中的平均含量可达10mg/kg。

⑷对人体的影响：膳食中的亚硝酸盐一般不危害人体健康，当人体摄入总量达0.3～0.5g时，会引起中毒；当摄入总量达3g时，会引起死亡。

⑸我国卫生标准：国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。

⑹绝大多数亚硝酸盐随尿液_ 排出，但在特定条件下，即适宜的pH 、温度

和一定的微生物_ 作用，会转变成致癌物质亚硝胺。 4.测定亚硝酸盐含量的原理

（1）在盐酸酸化

条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N—1—萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红_色染料。

（2）将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液目测进行比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。 三、泡菜腌制过程

1.泡菜坛的选择

（1）应选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、

盖子吻合好的泡菜坛。

（2）检查时可将坛口向上压入水中，看坛内有无渗水_现象。

2.腌制

（1）过程：

①将新鲜蔬菜预先处理成条状或片状。

②泡菜盐水按清水和盐为4∶1质量比配制煮沸冷却备用。

③预处理的新鲜蔬菜装至半坛

时放入

蒜瓣、生姜、香辛料

等佐料，

(如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。)并继续装至八成满。

④倒入配制好的盐水，使盐水

没过全部菜料

。

⑤盖上泡菜坛盖子，并用水密封发酵。以保证坛内为无氧环境。

发酵时间受到

温度

影响。

注意：

①

水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中21％是氧气，这是最简易的造成无氧环境的方法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂。

②

泡菜发酵分为：

发酵前期：蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、CO2等称异型乳酸发酵。

●

泡菜坛内有时会长一层白膜，形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。

●

酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。

发酵中期：由于前期乳酸的积累，pH下降，嫌气状态的形成，乳酸杆菌活跃进行活跃的同型乳酸发酵，乳酸积累pH达3.5~3.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段

。发酵产物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵。

发酵后期：继续进行乳酸发酵，乳酸积累达1.2％以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。

腌制1周左右即可开坛食用。也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。

一般在腌制

10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好。

四、亚硝酸盐的测定

测定步骤

配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。

1. 配制溶液

： 对氨基苯磺酸溶液 N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液 亚硝酸钠溶液

提取剂

（氯化镉、氯化钡

）：作用：增大亚硝酸钠的溶解度

氢氧化铝乳液（作用：作吸附剂，充分使滤液脱色）

2.5mol/l的氢氧化钠溶液（中和过多盐酸，营造碱性环境）

2.制备标准显色液

用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亚硝酸钠溶液，分别置于50ml比色管中，再取1支比色管作为空白对照。并分别加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5分钟后，再分别加入1.0ml N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至50ml，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化。

静置

N-1-萘基乙二胺盐酸盐

亚硝酸钠

溶液

对氨基苯磺酸溶液

3～5分钟

3.制备样品处理液的步骤是

①称取 0.4 kg泡菜，粉碎榨汁，过滤得约200mL汁液。

②取100mL汁液倒入500mL容量瓶，添加200mL 蒸馏水

和100mL 提取剂

，摇床振荡1h，再加40mL 氢氧化钠溶液

，最后用

蒸馏水

定容到500mL并立刻

过滤

获得滤液。

③

将滤液60mL移入100mL容量瓶，用

氢氧化铝乳液（吸附脱色）定容后过滤，获得

无色透明

的滤液。

汁液

蒸馏水

加

氢氧化钠定容

取泡菜

榨汁

过滤

氢氧化铝乳液定容

4.比色：

亚①将40mL滤液移入50mL比色管中，并编号。

硝②分别依次加入2.0mL的对氨基苯磺酸溶液

和1.0mL的 N-1-萘基酸乙二胺盐酸溶液

，并定容到50mL，混匀静置15min。

盐③观察颜色变化，并与

标准显色液

比较，记录亚硝酸盐含量。

含+ 量

发酵时间（d）

（1）亚硝酸盐含量在第 6天达到最高峰。

（2）亚硝酸盐含量升高的原因是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。

（3）亚硝酸盐含量降低的原因：随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，同时形成的亚硝酸盐又被分解，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。

④计算样品滤液（40mL）中亚硝酸盐含量。

计算公式是：

样品中亚硝酸盐含量（mg）

取样量（40mL滤液的质量，Kg）

专题2 微生物的培养与应用

课题1 微生物的实验室培养

一、基础知识

1.培养基

培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

（1）

培养基分类

①

按照物理性质可分为

液体培养基：应用于工业或生活生产

半固体培养基：主要用于鉴定微生物运动力

固体培养基：应用于微生物的分离、计数和鉴定

注意：在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。

②

按照成分培养基可分为

人工合成培养基：用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定

天然培养基：是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。

③

按照培养基的用途，可将培养基分为

选择培养基：是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。（如：加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌）

•

加入高浓度食盐的培养基 ------------- 分离金黄色葡萄球菌

•

不加氮源的无氮培养基 -----------------分离固氮菌

•

不加含碳有机物的无碳培养基 ----------分离自养型微生物

•

加入青霉素等抗生素的培养基 -----------分离导入了目的基因的受体细胞

鉴定培养基：是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。（伊红和美蓝培养基可鉴别大肠杆菌）

（2）培养基的化学成分一般都含有水

、

无机盐

、

碳源

、

氮源

、四类营养成分

。

·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类（最常用的碳源，尤其是葡萄糖）、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3、NH4（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。氮源主要用于合成蛋白质、核酸以及

-+

有的碳源只能是碳源;如CO2。有的碳源可同时是氮源。如NH4HCO3。有的碳源可同时是能源，如葡萄糖

有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨

含氮的代谢产物.

●在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对PH、特殊营养物质（生长因子）以及氧气等的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需要将培养基的PH调至酸性；培养细菌时需要将培养基的PH调至中性或微碱性；培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件。

2.无菌技术

（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。避免杂菌污染的方法主要包括以下四个内容：

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。

灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

●消毒和灭菌的比较

比较项

理化因素的作用强度

消毒

灭菌

（2）实验室常用的消毒方法是煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）

，此外，人们也常使用化学药剂进行消毒，如用_酒精、氯气、 等。常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

，此外，实验室里还用紫外线_或_化学药物（石碳酸或煤酚皂）进行消毒。

灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱

；

较为温和

强烈

消灭微生物的数量

部分生活状态的微生物

全部微生物

芽孢和孢子能否被消灭

不能

能

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅

。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯

。

注意：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还

能有效避免操作者自身被微生物感染。

二、实验操作

1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤：

计算

→称量→溶化_→灭菌→倒平板

注意：培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。

可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

（2）倒平板的过程

①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。（通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。）

③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培

养皿盖在下、皿底在上。

（平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。）

注意：①在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板就不能用来培养微生物了。国为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

②如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

2.纯化大肠杆菌

（1）微生物接种的方法中最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

平板划线法是指通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

稀释涂布平板法是指将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

注意：用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

（2）平板划线的操作步骤如下：

①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。

③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后（以免接种环温度太高，杀死菌种。），从第 一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最 后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

注意：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。