课题3　血红蛋白的提取和分离课堂实录及点评

高中生物选修一生物技术实践 专题五

ＤＮＡ和蛋白质技术

课题一

ＤＮＡ的粗提取与鉴定

·提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

·DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？

在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。

·在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

·采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？

将DNA和蛋白质进一步分离。

·提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？

蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。

补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。

·洗涤剂在提取DNA中有何作用？

洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。

·当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定？

在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。

原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。

实验材料的选取

不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

破碎细胞，获取含DNA的滤液

·若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？

在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。

·为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

·在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。

·在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？

破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

。具体做法。10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液

去除滤液中的杂质

为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

方案二与方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

析出与鉴定

·在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？

滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。

·怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？

具体做法。试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化

实验操作

制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心

↓

破碎细胞，释放DNA…

加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌

↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA…………

加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌

↓

DNA析出………………

加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中

↓→除去细胞质中的大部分物质。

DNA初步纯化…………

与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物

↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鉴定………………

二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。