课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数全国优秀课堂实录

专题2 课题2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》

学习目标：

1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。

2.掌握土样的选取和选择培养基的配制方法。

3.掌握分解尿素的细菌的计数方法。

学习重点、难点：

1.掌握土样的选取和选择培养基的配制方法。

2.掌握分解尿素的细菌的计数方法。

使用说明与学法指导：

通读教材P21-26页内容，作好必要的标注和笔记，认真完成导学案中的预习案。

预习案

一、问题导学

我们都知道尿素是一种重要的农业氮肥，但是尿素不能直接被农作物吸收，只有土壤中的细菌将其分解成氨之后才能被植物利用。如果我们想对土壤中分解尿素的细菌进行培养并计数，应该如何操作呢？操作过程中要注意什么呢？

二、知识梳理

一、研究思路

1．筛选菌株

(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于____________生长的条件(包括营养、_______、pH等)，同时_______或_______其他微生物的生长。

(2)选择培养基：在微生物学中，将允许_______种类的微生物生长，同时_______或_______其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

2．统计菌落数目

(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。

①原理：当样品的__________足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个_______。通过统计平板上的__________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的____________。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的_______(mL)。

M：代表____________。

③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在____________的平板进行计数，并取其__________。

(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。

3．设置对照

(1)对照实验：指除了__________的条件外，其他条件都相同的实验。

(2)主要目的：排除实验组中____________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计

1．土壤取样

从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约___cm的土壤层取样。

2．样品的稀释

(1)稀释原因：样品的__________直接影响平板上生长的____________。

1

(2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在__________之间，便于计数。

3．微生物的培养与观察

(1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养_______和培养_______。

(2)观察：每隔______统计一次_______数目，最后选取菌落数目_______时的记录作为结果。

三、操作提示

1．无菌操作

(1)取土样的用具在使用前都需要_______。

(2)应在酒精灯_______旁称取土壤，并在酒精灯火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好_______。

(3)在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在酒精灯_______旁操作。

2．做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好_______。

3．制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先____________，以便提高工作效率。

四、菌种鉴定

1．原理：分解尿素的细菌合成的_______将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

2．方法：在以_______为唯一氮源的培养基中加入_______指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

三、预习自测

(1)选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。( ) (2)统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。( ) (3)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。( ) (4)设置对照的目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。( ) (5)统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。( ) (6)统计菌落数目时应选取菌落数目稳定时的记录作为结果。( ) 探究案

探究一

筛选菌株及菌落的计数

1．筛选菌株的原理

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出________和______；加入高浓度的食盐可以得到_____________。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离______微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能_____________的微生物；用含无机碳源的培养基分离________微生物。

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到________的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离______型和__________型微生物。

【微提醒】

能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。

2．统计菌落数目的方法

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直2

接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：

项目

直接计数法

利用特定________________或原理

________________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量

主要用具

计数数据

优点

缺点

计算公式

_______本身

计数方便、操作简单

____菌、____菌都计算在内

每毫升原液含菌数

＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数

间接计数法

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个_______，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的_______数，就能推测出样品中大约含有多少活菌

培养基上_______数

计数的是____菌

操作较复杂，有一定误差

每毫升原液含菌数＝

平均菌落数×_______倍数÷涂布液_______ 【微提醒】

(1)间接计数法统计的菌落数往往比活菌的实际数目_____，原因：

①当两个或多个细菌连在一起繁殖时，平板上观察到的只是一个菌落；

②统计结果只是活细菌产生的菌落数，而不包括死细菌数目。

(2)为使结果接近真实值，一般选择菌落数在____～______的平板进行计数；要设置_______组(三个或三个以上)，取其平均值。

例1．高温淀粉酶在大规模工业生产中有很强的实用性。研究者从热泉中筛选了能高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如图所示。下列说法不正确的是(

)

A．1号培养基是以淀粉为唯一碳源的选择培养基

B．1号培养基形成菌落后，应该筛选加入碘液后颜色变浅的菌落

C．在1号培养基和2号培养基上都可以获得单菌落

D．划线前一定要对接种环灼烧灭菌，但划线后无须灭菌

例2．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：

步骤如下：①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

②为了得到更加准确的结果，应选用________法接种样品。

③适宜温度下培养。

结果分析：

(1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是________。

A．涂布了1个平板，统计的菌落数为230 B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235 3

(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)____________。

(3)用这种方法测定的细菌数量要比实际活菌数量________(填“多”或“少”)，因为________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

探究二

实验设计及结果分析

1．实验流程

土

壤

取

样―→制备培养基―→样品稀释涂布平板―→观察培养―→菌落计数

稀释度

菌落数/平板

菌数/克(土壤)

2.实验设计原则

(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布____个平板作______组，以增强实验结果的说服力与准确性。

(2)设立两种对照组

①判断培养基中是否有杂菌污染，需同时将__________的选择培养基进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立________________培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。

3．结果分析与评价

内容

有无杂菌污染的判断

选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

菌数，原因是

(

) A．平板上的一个菌落就是一个细菌

B．菌落中的细菌数是固定的

C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌

D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同

现象

对照的培养皿中无菌落生长

培养基中菌落数偏高

菌落形态多样，菌落数偏高

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板

结论

_____杂菌污染

_____杂菌污染

培养基中混入其他_______ 选择培养基_____筛选作用

操作________ 104

1

2

3

平均值

1

2

105

3

平均值

1

2

106

3

平均值

若选取同一种土样，统计结果应________ 例3．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活训练案

[习题训练]

4

1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(

) ①加尿素

②不加尿素

③加琼脂

④不加琼脂

⑤加葡萄糖

⑥不加葡萄糖

⑦加硝酸盐

⑧不加硝酸盐

A．①③⑤⑦

C．①③⑤⑧

A．一个细菌，液体培养基

B．许多细菌，液体培养基

C．一个细菌，固体培养基

D．许多细菌，固体培养基

3．下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，错误的是(

) A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

4．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，正确的是(

) B．②④⑥⑧

D．①④⑥⑦

2．产生每个标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是(

)

A．3号试管中的细菌稀释倍数为103倍

B．4号中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为5号的10倍

C．5号试管的结果表明每克土壤中的细菌数为1.7×109个

D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际细菌数目高

5．下表为某微生物培养基的配方，请回答：

成分

NaNO3

K2HPO4

琼脂

MgSO4·7H2O 含量

3 g 1 g 15 g 0．5 g,

成分

FeSO4

(CH2O) H2O 青霉素

含量

0．01 g 30 g 1 000 mL 0．1万单位

(1)该培养基中的碳源是________，依用途划分，该培养基属于________培养基。不论何种培养基，各成分在溶化分装前，要进行的是________。

(2)若用该培养基培养尿素分解菌，应除去的物质是________，加入的物质是________。

(3)为检测尿素分解菌的存在与否，还应加入________________________，将呈________反应。

6．尿素是一种重要的农业氮肥，但尿素只有通过土壤中某些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下：

KH2PO4

1.4 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 蛋白胨

1.0 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

1.0 g 琼脂

15.0 g 蒸馏水

定容至1 000 mL (1)分解尿素的细菌都能合成________，该种细菌在生态平衡中起到什么作用？________________。写出细菌分解尿素的反应式：___________________。

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(2)根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？________(填“能”或“不能”)，原因是____________________。

(3)分离得到分解尿素的细菌后，如果要扩大培养，则应选择________培养基进行培养。培养一段时间后，使用________对微生物细胞进行计数。计数过程中，下列行为会影响计数的准确性的是(

) A．计数时直接从静置培养的试管底部取培养液进行计数

B．如果方格内微生物细胞数量多于300个，培养液先稀释后再计数

C．如果微生物细胞有粘连，要数出团块中的每一个细胞

D．压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数

(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后再倒掉。

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