课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数国家优质课一等奖

选修

1（生物技术实践）·专题

2（微生物的培养与应用）

课题

2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

【课题目标】

【课题重点】

对土样的选取和选择培养基的配制。

【课题难点】

对分解尿素的细菌的计数。

（1）研究培养基对微生物的选择作用；

（2）进行微生物数量的测定。

【实验原理】

（一）尿素及分解尿素的细菌

尿素是一种重要的氮肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨

和

CO2

之后，才能被植物利用。

分解尿素的细菌能合成脲酶，从而将尿素分解，反应式为

脲酶

CO（NH2）2+H2O  CO2+2NH3 。

（二）研究思路

1.筛选菌株

（1）筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。例如，科学

家能从热泉中把耐热细菌筛选出来，是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物。

（2）筛选方法：

利用以尿素为唯一氮源的选择培养基来筛选。

①选择培养基的概念：选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。例如，含氨苄

青霉素的培养基，选择保留有氨苄青霉素抗性的细菌。

②选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

③选择培养基的用途：使混合菌种中的劣势菌变成优势菌，提高该菌的筛选率。

④选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。

成

分

用

量

作

用

Na2HPO4 KH2PO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

水

2.1g 1.4g 0.2g 10.0g

无机盐

碳源

氮源、碳源

凝固剂

1.0g 15.0g 溶解后定容至

1000mL

水

思考：该培养基的选择机制是只有能够以尿素作为氮源（能合成脲酶）的微生物才能在该培养基上生长。

2.统计菌落数目

测定微生物数目的方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法。

（1）稀释涂布平板法

常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法，即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释

液中的一个活细菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在

30～300

的平板进行计数。

②设置重复组，增强实验的说服力与准确性：将待测样品经一系列

10

倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取

0.1mL

接种到

已制备好的平板上，用无菌涂布法将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养计算菌落数。为使结果接近真实值，同一稀释度下

至少涂布 3 个平板作为重复组，然后培养计算出菌落平均数。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有

误，需要重复实验。

③一般来说，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因

此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

④涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在

50

个左右为最好。

⑤计算公式：每

g

样品中的菌株数＝ 某一稀释度下平板生长平均菌落数 稀释倍数涂布平板时所用稀释液的体积（mL）

（2）显微镜直接计数法

①显微镜直接计数法原理

显微镜直接计数法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积

1mm

和高

0.1mm

的计数室，在

1mm

的面积里又被划分成

25

个（或

16

个）中

22格，每个中格进一步划分成

16

个（或

25

个）小格，但计数室都是由

400

个小格组成。

②显微镜直接计数法操作步骤

A.取清洁的血球计数板，在计数室上面加盖盖玻片；

B.取菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡；

C.用显微镜 10×物镜观察并将计数室移至视野中央；

D.在 10×物镜下计数：计数 5 个（或 4 个）中格的总菌数，然后求得每个中格的平均值，再乘上 16（或 25）就得出计数区的总

菌数，最后再换算出每

mL

菌液中的含菌数。

注意：计上不计下，计左不计右。

3.设置对照

目

的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

对照实验：是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。

例如，在做本课题的实验时，A

同学从对应

10

倍稀释的培养液中筛选出大约

150

个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选

6择出大约

50

个菌落。分析可能的原因如下：

可能原因

实验验证

结

论

所取土样不同

其他同学用与

A

同学一样的土

若结果与

A

同学的一致，则说明土样没问题；

若结果与

A

同学的不一致，则说明

A 同学操作失误或培养

样进行实验。

将

A

同学配制培养基在不加土

培养基污染或操作失误

基配制有问题。

若有菌落出现，则说明培养基被污染；

样的情况下进行培养，作空白对照。

若无菌落出现，则说明培养基未被污染。

【实验设计】

土壤取样

样品稀释 涂布平板 培

养 观察计数

【实验操作】

操作步骤

相关说明

（1）一般要铲去表土：土壤微生物约

70%～90%为细菌，主要分布在距地表

3～8cm 的

土壤层。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

土壤取样

（2）需要无菌操作：应在火焰旁称取土壤。称好的土样倒入盛有无菌水的锥形瓶中，塞

好棉塞。

（1）样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数。

思考：样品稀释的目的是保证获得菌落数在 30～300 之间的平板。

（2）不同的微生物采用不同的稀释度。

样品稀释

思考：采用不同的稀释度的原因是不同微生物在土壤中含量不同。例如，细菌稀释度为

104、105、10，放线菌稀释度为

103、104、10，真菌稀释度为

10、10、1。

（3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

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生物选修

1（生物技术实践）校本教材（第

20

页）

操作步骤

相关说明

（4）为避免试管相互混淆，将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次

放置在试管架。

样品稀释

培

每隔

24 h

统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不

平板较多，使用前做好标记。

标记培养皿时，注明培养基种类、培养日期、培养样品的稀释度等。

涂布平板

不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。例如，细菌一般在

30～37℃培养

1～2d，

养

放线菌一般在

25～28℃培养

5～7d，霉菌一般在

25～28℃的温度下培养

3～4d。

足而导致遗漏菌落的数目。一定培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，例如，形状、

大小、隆起程度和颜色等。

不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、

硬度、透明度等方面具有不同的特征。每种细菌在一定条件下所形

成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。

菌

观察计数

落

形

状

大

小

隆起程度

颜

色

……

1

……

稀释度

10

4

101 5

101 2 6 1 2 菌落数/平板

菌数/g

土壤

3 平均值

2 3 平均值

3 平均值

【结果分析与评价】

1.操作中的注意事项

（1）无菌操作：各种用具在使用前需灭菌；取样和稀释过程在火焰旁操作。

（2）做好标记：在进行多组实验过程中，应注意做好标记，其目的是避免混淆。

思考：应标记哪些内容？怎样操作更有利于实验的进行？

培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放置在试管架的另一行。

（3）规划时间：以便提高工作效率，操作时有条不紊。

2.实验结果评价

（1）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说

明选择培养基已筛选出一些菌落。

（2）样品的稀释操作是否成功

如果得到了

2

个或

2

个以上菌落数目在

30～300

的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

3.课题延伸

在细菌分解尿素的化学反应中生成了氨，会使培养基的碱性增强，pH

升高。因此，我们在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红

指示剂。培养某种细菌后，如果

pH

升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。