课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段名师教学视频（文字实录）

课题：多聚酶链式反应扩增DNA片段

教学目标：

（一）知识与技能

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

（二）过程与方法

本节内容虽然是实验课，但是学校不具备开展的条件，所以只能是理论的学习，通过对PCR技术的学习，让学生在必修二的基础上对DNA分子的复制有更深的了解

（三）情感、态度与价值观

通过对PCR技术的学习，了解生物科学技术在生活中的运用，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作

教学难点：PCR的原理

教学过程：

引入新课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

一、基础知识

1、DNA分子的组成成分和结构

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

2、细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 细胞内DNA复制条件分析：（必修二DNA复制图片）

条件

模板

原料

酶

能量

引物

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

DNA聚合酶

ATP RNA 作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

补充知识1 DNA聚合酶的特点：不能从头合成DNA，只能从3'端延伸DNA，因此DNA复制需要引物，为DNA聚合酶提供3'端

引物：是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链一段碱基序列碱基互补配对，用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸

补充知识2：DNA的半不连续复制（结合半不连续复制模式图）

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

二、PCR技术

1．PCR的原理：体外模拟细胞内DNA的复制

DNA模板

2.条件 DNA聚合酶

两种引物

四种脱氧核糖核苷酸

另外，PCR技术需要在一定的缓冲溶液中才能进行

［思考］模拟细胞内DNA的复制面临的首要问题是：

DNA双链如何解开，如何保持单链状态？

细胞内复制DNA用的是解旋酶使得双链打开，然后DNA单链结合蛋白与解开的单链结合，使单链状态得以保持。

补充知识3:DNA分子的热变性原理

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

变性

复性

延伸

3.PCR的过程：变性、复性、延伸（图片展示）

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

PCR仪（自动温度周期性调节）。

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸

三、实验操作

（一）设备及用具（图片展示）

1、PCR仪：实质上一台能够自动调控温度的仪器

2、微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

（二）实验操作步骤

1、准备：按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上

2、移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂

3、混合：

①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

②注意：

A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢

B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀

4、离心

①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果

5、反应：将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序

循环数

第一次

变性

94°C，10min 复性

－

延伸

－

30次

９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次

９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min

（三）实验注意事项

1、避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

2、缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3、每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

4、混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

（四）结果分析与评价

理论上DNA扩增数目的计算

1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n 实验中DNA含量的测定

1 、原理

可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关

2 、过程

1、反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

2、将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

3、计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

四、板书设计

多DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

PCR原理

聚DNA的变性和复性受温度影响

酶

链

式PCR过程

变性

复性

延伸

反

应

扩操作步骤

移入离心管

配制PCR反应体系

增

DNA扩增

设置工作参数

放入PCR

片

段测定含量

稀释

调零

计算

测定并读数

DNA